Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Kết quả khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real time PCR
Kết quả thử nghiệm tính định lượng của phương pháp Real - time PCR ở các nồng độ pha lỗng của mẫu 1 sau các lần lặp lại thể hiện qua Hình 4.8.
Hình 4.8 thể hiện rõ các đường cong tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở các nồng độ pha lỗng của mẫu 1. Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ pha lỗng rất đều thể hiện tính tuyến tính cao, tính tuyến tính càng cao thì khả năng định lượng số bản sao ban đầu càng chính xác. Ở nồng độ pha lỗng 10-1
, 10-2, 10-3, chu kỳ ngưỡng ở từng lần lặp lại sai lệch rất thấp. Điều này chứng tỏ độ lặp lại thể hiện khá cao. Ở nồng độ bắt đầu pha lỗng 100, tín hiệu huỳnh quang thu được của mẫu cĩ chu kỳ ngưỡng lên rất sớm: 16,34, chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại cũng khá đồng đều. Trong 3 lần lặp lại cĩ một chu kỳ ngưỡng lên sớm hơn, tách biệt khỏi chu kỳ ngưỡng của hai lần lặp lại cịn lại, tuy nhiên sự sai lệch này rất nhỏ: 0,39 chu kỳ, cĩ thể chấp nhận được. Sự sai lệch này cĩ thể do sai số pipet, thao tác người thực hiện,…
Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha lỗng sau 3 lần lặp lại thu được qua Hình 4.9.
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha lỗng lặp lại 3 lần của mẫu 1
: 100 : 10-1 : 10-2 : 10-3 ▲: các chuẩn : các mẫu : đối chứng âm
Số bản sao ban đầu ở các nồng độ pha lỗng lặp lại 3 lần của mẫu 1 được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.9. Hình 4.9 thể hiện rõ mối quan hệ tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng qua hệ số tương quan rất cao: r2 bằng 1. Hiệu quả phản ứng Real - time PCR này đạt cao (99,6%) chứng tỏ phản ứng này hoạt động tốt. Đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha lỗng của mẫu gần như trùng nhau.
Từ Hình 4.9 ta cĩ được độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha lỗng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.5 như sau:
Bảng 4.5 thể hiện rõ số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng và số bản sao trung bình giảm theo từng nồng độ pha lỗng. Chu kỳ ngưỡng trung bình càng cao tương ứng với số bản sao trung bình càng thấp. Sai lệch giữa các chu kỳ ngưỡng trung bình tương đối đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,2 đến 3,71. Sai lệch đều thể hiện tính tuyến tính về
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha lỗng lặp lại 3 lần của mẫu 1
Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha lỗng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại
Nồng độ mẫu 1
Chu kỳ ngưỡng trung bình
Số bản sao ban đầu
trung bình số bản sao ban đầu Độ lệch chuẩn của
100 16,77 4,89.106 1,38.106
10-1 19,97 5,25.105 0,63.105
10-2 23,37 5,02.104 0,84.104
khả năng định lượng cao của Real - time PCR. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu tương đối thấp, cho thấy độ lặp lại về khả năng định lượng cao.
Qua kết quả khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của R e a l - t i m e PCR trên các nồng độ pha lỗng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại cho thấy phương pháp Real - time cho kết quả định lượng chính xác số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng với độ lặp lại cao.
Tính định lượng của phương pháp Real - time PCR cịn được khảo sát qua mẫu 7, kết quả thu được qua Hình 4.10 và Hình 4.11.
Ở các nồng độ pha lỗng, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ thể hiện tuyến tính (Hình 4.10). Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ pha lỗng của mẫu 7 đều nhau thể hiện tính tuyến tính cao. Ở nồng độ 100
từng đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở các lần lặp lại hơi tách biệt nhau với độ lệch 0,43 chu kỳ. Ở nồng độ 10-1, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở một lần lặp lại tách biệt so với hai lần lặp lại cịn lại với sai lệch 0,2 chu kỳ. Sai lệch nhỏ này cĩ thể do sai
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha lỗng lặp lại 3 lần của mẫu 7
: 100 : 10-1 : 10-2 : 10-3 ▲: các chuẩn : các mẫu : đối chứng âm
số pipet và các tác động khác như thao tác người thực hiện,… Ở nồng độ 10-2
, 10-3, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở cả 3 lần lặp lại gần như trùng nhau. Điều này chứng tỏ độ lặp lại về khả năng định lượng của hệ thống cao.
Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha lỗng sau 3 lần lặp lại thu được qua Hình 4.11.
Số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha lỗng sau khi lặp lại 3 lần của mẫu 7 được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.11. Hình 4.11 cho thấy hiệu quả của phản ứng Real - time PCR đạt rất cao: 99,6%. Log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng cĩ quan hệ rất tuyến tính qua hệ số tương quan r2
bằng 1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha lỗng của mẫu qua 3 lần lặp lại trùng nhau hồn tồn và gần trùng nhau, cho thấy hệ thống cĩ khả năng cho kết quả định lượng chính xác với độ lặp lại cao.
Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha lỗng mẫu 7 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.6 như sau:
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha lỗng lặp lại 3 lần của mẫu 7
Bảng 4.6 cho thấy số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng dần và số bản sao trung bình giảm dần theo từng nồng độ pha lỗng. Khoảng cách giữa các giá trị của các chu kỳ ngưỡng trung bình ở các nồng độ tương đối đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,13 đến 3,75. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu rất thấp thể hiện độ sai lệch nhỏ và độ lặp lại thí nghiệm cao.
Như vậy, kết quả thử nghiệm tính định lượng của Real - time PCR trên hai mẫu 1 và 7 thể hiện rõ tính tuyến tính và độ lặp lại cao về khả năng định lượng của hệ thống, cĩ thể sử dụng để kiểm tra định lượng WSSV trên tơm sú.