I: quy trình ly trích 2 S: quy trình ly trích
PHỤ LỤ CC CÁC THUẬT TỪ THƢỜNG DÙNG TRONG REAL TIME PCR
REAL - TIME PCR
Background
Nền là tín hiệu huỳnh quang khơng đặc hiệu trong phản ứng, chẳng hạn do sự hấp thụ khơng hiệu quả tín hiệu huỳnh quang hay sự hiện diện với số lượng lớn ADN đích mạch đơi khi dùng SYBR Green I. Thành phần tín hiệu nền được loại bỏ nhờ phần mềm tốn học của Real - time cycler.
Baseline là mức độ nhiễu trong các chu kỳ từ 2 đến 15. Trong khoảng các chu kỳ này khơng cĩ sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số sản phẩm khuếch đại. Số chu kỳ để tính baseline cĩ thể thay đổi và giảm dần nếu số lượng mạch khuơn cao hay mức độ biểu hiện gen đích cao.
Biến tính (denaturation): biến tính của ADN là sự chuyển từ dạng mạch kép sang dạng mạch đơn. Tác nhân gây nên sự biến tính thường là nhiệt.
bp (base pair): cặp base, là liên kết A-T hoặc C-G trên một phân tử ADN mạch kép, và là đơn vị đo chiều dài của một phân tử ADN.
Cấu trúc kẹp tĩc (hairpin): một vùng xoắn kép hình thành từ sự bắt cặp bổ sung giữa hai trình tự bổ sung nằm kề nhau trên một phân tử ADN hay RNA mạch đơn.
Chu kỳ ngưỡng (Ct)
Là chu kỳ mà đường đồ thị khuếch đại vượt qua đường baseline subtracted. Tại điểm vượt qua đĩ, tín hiệu huỳnh quang tăng một cách thấy rõ. Chu kỳ ngưỡng được xem như một phương cách tính số khuơn mẫu ban đầu ở từng mẫu.
Đường chuẩn: đường chuẩn được dựng nên từ mẫu đã biết số bản sao ban đầu. Log của số bản sao (trục X) được dựng nghịch với chu kỳ ngưỡng (trục Y) tạo dựng nên đồ thị (graph). Phương trình của đường thẳng và hệ số tương quan r2
được thể hiện trên biểu đồ biểu diễn đường chuẩn.
Primer: một trình tự ADN hay ARN ngắn, bắt cặp với một mạch khuơn ADN và cĩ mang một đầu 3’OH tự do giúp ADN polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.
Probe: một đoạn ADN hay ARN chuyên biệt được đánh dấu bằng đồng vị phĩng xạ hay bằng hĩa chất, dùng để định vị một trình tự nucleic acid nhất định thơng qua kỹ thuật lai phân tử.
Quencher (Q): chất hấp thụ: tín hiệu huỳnh quang phát ra từ chất chỉ thị huỳnh quang (reporter hay fluorophore) được quencher hấp thụ khi probe ở dạng khơng bắt cặp với trình tự chuyên biệt.
Reporter (R): chất chỉ thị tín hiệu huỳnh quang
Tín hiệu huỳnh quang tạo ra trong suốt Real - time PCR qua SYBR Green I hay probe cĩ trình tự đặc hiệu được đánh dấu.
Tm (nhiệt độ nĩng chảy) (melting temperature): của một trình tự ADN là nhiệt độ ở đĩ cĩ một nửa số phân tử của trình tự đĩ bị biến tính.
Threshold
Ngưỡng được điều chỉnh sao cho giá trị ngưỡng nằm trên tín hiệu nền và dưới đường bằng của đồ thị khuếch đại. Ngưỡng phải nằm trong vùng tuyến tính với đường cong khuếch đại, thể hiện phổ PCR phát hiện tuyến tính dưới dạng hàm log (the detectable log - linear range of the PCR). Giá trị ngưỡng được thiết lập qua đồ thị khuếch đại hàm log nhằm xác định pha log tuyến tính của PCR. Nếu nhiều trình tự đích trong thử nghiệm Real - time PCR, ngưỡng được thiết lập cho từng trình tự đích.