2.5.1 Muối khoáng
Muối khoáng đƣợc tế bào cây sử dụng cho sự tổng hợp phân tử hữu cơ hay xúc tác các phản ứng enzyme. Những ion của muối hòa tan đóng vai trò quan trọng trong sự vận chuyển phân tử, điều hòa thẩm thấu và duy trì điện thế của cây trồng.
Nitơ, Phốtpho, Lƣu Huỳnh là thành phần của protein và acid nucleic. Magiê và một số vi lƣợng hình thành các phần chủ yếu của enzyme và cấu trúc tế bào, do đó xúc tác nhiều phản ứng khác nhau.
Canxi và acid boric đƣợc tìm thấy chủ yếu trong vách tế bào và Canxi có vai trò quan trọng trong sự ổn định màng sinh học.
Kali và Clo quan trọng trong sự điều hòa thẩm thấu, duy trì điện thế và hoạt tính enzyme.
Các nguyên tố đa lƣợng: N, P, K, S, Ca, Mg.
Các nguyên tố vi lƣợng: Fe, Cu, Mn, Co, B, I, Ni, Cl, Al (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].
Muối khoáng đa lượng
Nhu cầu của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các muối khoáng đa lƣợng cần cung cấp là muối Nitơ, Phốtpho, Canxi, Kali…
Nitơ thƣờng đƣợc dùng ở dạng Nitrat hoặc muối Amonium, Nitrit và Amoniac ít đƣợc dùng vì ở nồng độ thấp thì nó không đủ mà ở nồng độ cao thì nó gây độc. Phốtpho đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng mono hay dihydrogenphosphate Kali hay Natri. Một số dạng muối đƣợc sử dụng: NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4.
Canxi đƣợc cung cấp dƣới dạng muối Canxi Clorua: CaCl2.H2O hoặc CaCl2.2H2O. Cây trồng hấp thụ Ca ở dạng Ca2+.
Sự dƣ thừa hay thiếu hụt các chất khoáng đa lƣợng đều có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro, đôi khi còn có tác động đến hình thái của
mẫu cấy (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].
Muối khoáng vi lượng
Welander (1977) đã đƣa ra những bằng chứng cho thấy tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần nhiều khoáng vi lƣợng. Các nguyên tố khoáng vi lƣợng có thể có ảnh hƣởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (Beasley và cộng sự, 1974).
Sắt đƣợc đƣa vào môi trƣờng dƣới dạng muối vô cơ (FeCl3, FeSO4). Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu cho thấy sắt đƣợc dùng dƣới dạng Chelat kết hợp với Na2 – EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng từ từ ra môi trƣờng theo nhu cầu của mô thực vật. Sự hiện diện của nguyên tố Fe đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Legrand, 1975).
Muối khoáng vi lƣợng thƣờng dùng là Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Cobalt (Co), Boron (B), Idodine (I), Molypden (Mo)… Một số muối vi lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng là ZnSO4, CuSO4, MnSO4, CoCl2, KI…
2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn carbon
Trong môi trƣờng nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dƣỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đƣờng để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là sucrose, d – glucose,
d – fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon đƣợc sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trƣởng và yêu cầu thí nghiệm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.5.3. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dƣỡng khác nhau. Thông thƣờng thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trƣởng và phát triển của chúng. Khi tế bào và mô đƣợc nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Vì vậy chỉ có một số vitamin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol.
Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trƣởng của tất cả các tế bào. Các vitamin khác nhƣ Vitamin H, C, E đôi khi đƣợc thêm vào. Vitamin C đôi khi đƣợc dùng ở nồng độ cao nhƣ là một chất chống oxy hóa. Myo-inositol có ý nghĩa cải thiện các phản ứng in vitro và tăng trƣởng của cây trồng, đặc biệt ở cây đơn tử diệp
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.5.4. Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định
Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trƣởng của mô. Các chất bổ sung có nhiều loại nhƣ: nƣớc cam, nƣớc cà chua, khoai tây, chuối… Hiện nay, chất bổ sung đƣợc dùng phổ biến là nƣớc dừa.
Ảnh hƣởng của nƣớc dừa
Nƣớc dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trƣờng với lƣợng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng nhƣ sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978).
Từ việc sử dụng nƣớc dừa, nhiều mô thực vật đƣợc nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi nhƣ nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nƣớc chiết cà chua… Nhƣng thông thƣờng các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002).
Hoạt tính của nƣớc dừa khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế đƣợc BAP. Van Overbeek và csv (1941) cho thấy nƣớc dừa kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà độc dƣợc (Datura solanaceae) trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong nƣớc dừa giàu các
hợp chất nitơ dạng khử nhƣ các acid amin, ngoài ra nó còn chứa các hormone sinh trƣởng nhƣ cytokinin (Vũ Văn Vụ, 2003) [5].
Theo sự phân tích thành phần dinh dƣỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong nƣớc dừa có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin nhƣ thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đƣờng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.5.5. Độ pH và agar
pH của môi trƣờng nuôi cấy thƣờng ở khoảng 5,7 – 5,8. pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995).
Các mô thực vật đều đƣợc cấy trên môi trƣờng agar. Agar thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 6 – 10 g/l, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8 g/l (Ribeiro và csv, 2000) (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.5.6. Các điều kiện vật lý
Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cƣờng độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhƣng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cƣờng độ cao từ 3.000 - 10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dƣỡng sang tự dƣỡng có khả năng quang hợp. Dƣới cƣờng độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhƣng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trƣờng đất. Chƣa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trƣờng cấy mô, nhƣng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn neon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trƣờng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thƣờng đƣợc giữ ở 25 – 28o
C.
2.6. Một số nghiên cứu về nhân giống cây hoa Gloxinia
Đặng Phƣơng Trâm , nhân giống cây hoa sinningia bằng phƣơng pháp cấy mô
Nguyễn Thị Nhẫn, 1997 – 1999, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Gloxinia speciosa bằng phƣơng pháp nuôi cấy trong ống nghiệm
Nguyễn Quang Thạch, Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Xuân Trƣờng, Nguyễn Công Hoan, Nguyễn Thị Lý Anh, nghiên cứu nhân nhanh cây hoa chuông (Sinningia
2.7. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật 2.7.1. Khái niệm bức xạ 2.7.1. Khái niệm bức xạ
Bức xạ là sự phát năng lƣợng vào môi trƣờng dƣới dạng tia (tia bức xạ). Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đƣờng đi đều coi là tia ion hóa.
Tia ion hóa đƣợc chia làm 2 loại:
Sóng điện từ: tia Roentgen (tia X), tia Gamma (tia γ).
Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron …[45]
2.7.2. Bức xạ Gamma
Bức xạ gamma là bức xạ điện từ. Nó đi đƣợc khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên mạnh. Khi đi vào cơ thể, chúng sẽ tƣơng tác với các chất có trong cơ thể và tạo ra các điện tử thứ cấp. Các điện tử thứ cấp này là các hạt mang điện nên sẽ gây ra hiện tƣợng ion hoá dẫn đến việc phá hủy các tế bào sống trong cơ thể. Xác suất tạo ra các điện tử thứ cấp tỉ lệ với năng lƣợng của bức xạ gamma theo hàm mũ [46; 47]
2.7.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt)
Coban (Co60) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học. Đây là kim loại phóng xạ dùng trong xạ trị. Kim loại này có đặc tính tạo ra bụi mịn. Nguồn Co60 hữu dụng trong vòng khoảng 5 năm, nhƣng ngay cả sau thời điểm này, mức độ phóng xạ vẫn rất cao.
Nhiều sinh vật sống (kể cả ngƣời) phải cần đến một lƣợng nhỏ coban trong cơ thể để tồn tại. Coban là một thành phần trung tâm của vitamin cobalamin, hoặc vitamin B12.
Tên gọi Coban (cobalt) có xuất xứ từ tiếng Đức kobalt hoặc kobold, nghĩa là linh hồn của quỷ dữ. Tên này do những ngƣời thợ mỏ đặt ra vì nó mang tính độc hại, gây ô nhiễm môi trƣờng [46].
2.7.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion hóa trên cơ thể sống
Bức xạ là một trong những tác nhân gây ra sự tổn thƣơng bức xạ ở mức phân tử, tế bào và hệ thống cơ quan của cơ thể sinh vật.
Các nguyên tử bị ion hóa sẽ làm cho các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật có những biến đổi về hóa học. Khi bị tác động thì gene bị biến đổi. Tùy theo mức độ tác động của bức xạ mà gene bị thay đổi ở những mức độ khác nhau.
Sau khi nhận năng lƣợng của bức xạ ion hóa thì các tổ chức tế bào của cơ thể sinh vật sẽ chịu những biến đổi qua hai giai đoạn:
Giai đoạn hóa lý
Giai đoạn này rất ngắn (10-13
- 10-16 giây), trong giai đoạn này các phân tử sinh học chịu tác dụng gián tiếp và trực tiếp của bức xạ ion hóa.
- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp gây ion hóa và kích thích các phân tử trong tế bào làm tổn thƣơng các phân tử đó, đứt gãy liên kết trong các gene, các nhiễm sắc thể, làm sai lệch cấu trúc và tổn thƣơng đến chức năng của tế bào.
- Tác dụng gián tiếp: khi phân tử nƣớc trong cơ thể bị ion hóa sẽ tạo ra các gốc tự do, các gốc này có hoạt tính hóa học mạnh sẽ hủy hoại các thành phần hữu cơ nhƣ các enzyme, protein, lipit trong tế bào và phân tử DNA, làm tê liệt các chức năng của các tế bào lành khác. Khi số tế bào bị hại, bị chết vƣợt quá khả năng phục hồi của mô hay cơ quan thì chức năng của mô hay cơ quan sẽ bị rối loạn hoặc tê liệt, gây ảnh hƣởng đến cơ thể sinh vật [45].
Trong giai đoạn hóa lý một số phân tử sinh học quan trọng nhƣ enzyme, nucleoprotein đã bị tổn thƣơng, ngƣời ta gọi đó là những tổn thƣơng hóa sinh
Giai đoạn sinh học
Nếu những tổn thƣơng hóa sinh không phục hồi đƣợc, những tổn thƣơng chuyển hóa dẫn đến những tổn thƣơng hình thái và chức năng. Đó là giai đoạn sinh học của tác dụng bức xạ ion hóa. Giai đoạn sinh học có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm sau khi chiếu xạ.
2.7.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa
Theo các kết quả nghiên cứu của Rapport (1961), Feitz (1964) và Heis (1965) thì khi tia phóng xạ vào cơ thể sinh vật sẽ tác động vào nhân tố di truyền trong tế bào theo các dạng sau:
Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tƣợng đột biến nhiễm sắc thể.
Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA, làm biến đổi cấu tạo gene, khi gene tự tái sinh tạo nên gene đột biến và hình thành nên những tính trạng mới.
Sự tác động của tia phóng xạ lên nhân tố di truyền theo các cơ chế sau:
Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi - Làm biến tính base trên DNA nhƣng không phá hủy DNA.
- Làm tách base khỏi khung ribose phosphate của DNA gây đứt chuỗi polynucleotide.
- Tạo các cầu nối đồng hóa trị giữa các base tƣơng xứng từ hai mạch của DNA, làm đứt đoạn DNA và gây ngắn chuỗi DNA.
Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi -Tạo các chất tƣơng tự base của DNA.
-Tạo các chất gây ngừng nhân đôi DNA hoặc gây loại trừ các base.
-Gây sự giao động tại chỗ do chuyển động nhiệt của các nguyên tử trong các base của DNA, gây rối loạn các phản ứng sinh lý, sinh hóa…
Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA
-Làm rối loạn chuỗi phản ứng sinh tổng hợp các base DNA, enzyme… -Làm biến đổi enzyme DNA polymerase
Ảnh hƣởng phối hợp
Tác nhân gây ảnh hƣởng lên hệ thống sửa chữa DNA, làm tăng dần số đột biến tự nhiên. Bức xạ ion hóa gây tác động tổng hợp tạo các mảnh đứt DNA hoặc tạo sự khâu mạch giữa hai chuỗi polynucleotide gần nhau và đối với vài trƣờng hợp có thể gây sắp xếp lại trật tự trên nhiễm sắc thể.
2.7.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ
Ngoài nước
Phƣơng pháp gây đột biến gene bằng tia phóng xạ đã đƣợc nghiên cứu từ lâu. Năm 1925, Muller đã tiến hành thành công những công trình nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra đƣợc những sinh vật biến dị nổi bật. Vì vậy năm 1925 đƣợc xem là năm ra đời ngành di truyền học phóng xạ.
Ở Mỹ, Humphrey (1951), Rauling (1958), William (1960) và ở Đức, Jashchariss (1956) sau khi nghiên cứu xử lý tia phóng xạ trên cây trồng đều đi đến kết luận: "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trƣởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng". Đa số các thí nghiệm đã chọn và thu các biến dị có lợi nhƣ: rút ngắn thời gian sinh trƣởng, tăng năng suất, tăng tính kháng sâu bệnh, ít đổ ngã, thấp cây, phân cành nhiều, tăng số lƣợng hoa, đổi màu hoa, tăng trọng lƣợng hoa.
Năm 1964, tổ chức phối hợp FAO/IAEA (Cơ quan lƣơng nông liên hiệp quốc/ Cơ quan nguyên tử năng quốc tế) đƣợc thành lập và tổ chức này đã công bố 1019
giống đột biến ở những cây có hạt đƣợc đƣa vào sản xuất và 523 giống đột biến ở những cây sinh sản vô tính và các cây làm cảnh khác nhau. Nhiều loại cây trồng quan trọng có số đột biến lớn nhƣ: Đại mạch, Lúa, Lúa mì mềm, Đậu phộng, Đậu nành, Lúa mì cứng, Đậu Hà Lan, Bông vải, Kiều mạch và rất nhiều giống hoa khác nhau.
Năm 2002, nhóm khoa học của Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha (Ấn Độ), đã dùng tia gamma yếu khử gần hết các thành tố axit oligosacharide dƣới vỏ đậu Hà Lan và còn rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hƣởng của tia gamma trên thực vật.
Trong nước
Tại Việt Nam từ năm 1965 – 1970 các nghiên cứu chọn giống đột biến cây trồng đƣợc bắt đầu thực hiện ở Đại học Tổng Hợp Hà Nội. Sau đó, các cơ sở nghiên cứu khác nhƣ: Viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học nông nghiệp, Viện di truyền học, Viện cây lƣơng thực và thực phẩm, các trƣờng Đại học nông nghiệp… tiến hành thí nghiệm với tia gamma trên những đối tƣợng cây trồng khác nhau.
Năm 1968, Đại học nông nghiệp I (Hà Nội) đã xử lý phóng xạ Co60
trên đậu nành, thu đƣợc một số dòng có triển vọng nhƣ: M103, A75, A9 có năng suất cao.
Năm 1977, Đại học nông nghiệp IV xử lý tia γ (Co60) trên giống đậu nành Santamaria tạo đƣợc hai giống: A1, A5 có năng suất cao, rút ngắn thời gian sinh