3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Pha môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA khác nhau tùy theo từng nghiệm thức.
Môi trƣờng đƣợc cho vào bình nƣớc biển có dung tích là 250 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng hấp ở 121oC; 1,2 atm trong 25 phút.
3.4.2. Nội dung thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thiết kế thí nghiệm:
Cây hoa Gloxinia in vitro (đã đƣợc cấy chuyền 3 tháng), mẫu cấy là các chồi đơn cao 1 cm. Gồm 4 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của tia đến sự sinh trƣởng và biến đổi kiểu hình cây
hoa Gloxinia in vitro.
Mẫu cấy tạo cây hoàn chỉnh trong môi trƣờng chiếu xạ MS có chất điều hòa sinh trƣởng IBA
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến biến đổi kiểu
hình của cây hoa Gloxinia in vitro.
Mẫu cấy nhân chồi trong môi trƣờng MS có chất tạo cây điều hòa sinh trƣởng BA hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và bức xạ đến sự
sinh trƣởng và biến đổi hình thái của cây hoa Gloxinia in vitro.
Mẫu cấy nhân chồi trong môi chiếu xạ tạo cây hoàn
trƣờng MS có chất điều chỉnh
hòa sinh trƣởng BA
Thí nghiệm 4: Trồng thử nghiệm cây Gloxinia in vitro ngoài vƣờn ƣơm
Cây con ở thí trồng thử nghiệm ngoài trên giá thể trên giá thể
Ghi chú: Giai đoạn xử lý phóng xạ : các cây Gloxinia in vitro (sau 15 ngày
cấy chuyền từ bình giống ban đầu) đƣợc đem đi xử lý phóng xạ với các liều lƣợng khác nhau.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: cây sẽ đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng MS có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng IBA (Indole-3-butyric acid) 2 mg/l.
Thí nghiệm 1: "Ảnh hưởng của tia đến sự sinh trưởng và biến đổi kiểu hình
cây hoa Gloxinia in vitro"
Các chồi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có IBA 2 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh. Sau đó các cây con đƣợc đem chiếu xạ từ 1 – 4 krad.
Vì vậy thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức liều xạ và 1 nghiệm thức đối chứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
Nghiệm thức Liều lƣợng tia Gamma (krad) Thời gian xử lý (giây)
1.1 (đối chứng) 0 0
1.2 1 23,14 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.3 2 66,89
1.4 3 110,63
1.5 4 154,37
Ghi chú: Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng
IBA (2 mg/l).
Số nghiệm thức: 5
Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu cấy trong mỗi bình: 4 Tổng số bình: 45
Tổng số mẫu: 180
Chỉ tiêu theo dõi: 15 ngày theo dõi 1 lần, theo dõi sự sinh trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây Gloxinia in vitro sau khi chiếu tia , gồm các chỉ tiêu sau:
Tỷ lệ cây sống sót
Tỷ lệ sống sót = (số cây sống sót / số mẫu đã cấy)*100 Theo dõi sau ngày xử lý, đếm số cây sống sót.
Tỷ lệ cây ra rễ
Thời gian ra rễ (ngày) tính từ ngày cấy chuyền đến khi 50% cây ra rễ. Đếm số lƣợng cây ra rễ ở từng nghiệm thức từ ngày cấy chuyền đến khi ra vƣờn ƣơm.
Sự tăng trƣởng chiều cao Chiều cao cây (cm)
Số lá trên cây
(Đếm trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm)
Ảnh hƣởng của liều lƣợng chiếu xạ đến đặc điểm hình thái - Lá:
Quan sát và đếm số lƣợng cây bị biến dị lá.
Tần số biến dị lá = (số cây bị biến dị lá / số cây quan sát)*100 Biến dị lá gồm những thay đổi về:
+ Màu sắc + Hình dạng + Kích thƣớc - Thân:
Quan sát thân cây và đếm số cây bị biến dị thân.
Tần số biến dị thân = (số cây bị biến dị thân / số cây quan sát)*100 Biến dị thân gồm tất cả các thay đổi trên thân nhƣ: thân to hay nhỏ, thân cao hay thấp, màu sắc của thân …
(Khảo sát trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm).
Thí nghiệm 2: "Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA đến biến đổi kiểu
hình của cây hoa Gloxinia in vitro"
Các chồi Gloxinia đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung BA gồm 2, 4, 6, 8 mg/l. Do đó, thí nghiệm bao gồm 5 nghiệm thức: 4 nghiệm thức BA và 1 nghiệm thức đối chứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
Nghiệm thức BA (mg/l) 2.1 (đối chứng) 0 2.2 2 2.3 4 2.4 6 2.5 8
Ghi chú: môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng MS có bổ chất điều hòa sinh trƣởng BA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
với các nồng độ khác nhau. Số nghiệm thức: 5 Số bình của 1 nghiệm thức: 3 Số mẫu trong 1 bình: 4 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu cấy: 180
Chỉ tiêu theo dõi: 15 ngày theo dõi 1 lần, theo dõi sự sinh trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro sau khi cấy chuyền, gồm các chỉ tiêu sau:
Hệ số nhân chồi
Hệ số nhân chồi = tổng số chồi hình thành / tổng số mẫu đã cấy.
Tần số biến dị
Tần số biến dị = (số chồi bị biến dị / số mẫu đã cấy)*100
Ảnh hƣởng của nồng độ chất kích thích sinh trƣởng BA đến đặc điểm hình thái
- Sự tăng trƣởng chiều cao - Chiều cao cụm chồi (cm)
(Đếm trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm) - Lá:
Quan sát và đếm số lƣợng chồi bị biến dị lá.
Tần số biến dị lá = (số cây bị biến dị lá / số cây quan sát)*100 Biến dị lá gồm những thay đổi về:
+ Màu sắc + Hình dạng + Kích thƣớc - Thân:
Quan sát thân cây và đếm số cây bị biến dị thân.
Tần số biến dị thân = (số cây bị biến dị thân /số cây quan sát)*100 Biến dị thân gồm những thay đổi:
+ Thân to hay nhỏ + Thân cao hoặc thấp + Màu sắc của thân
Thí nghiệm 3: "Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và bức xạ đến
sự sinh trưởng và biến đổi hình thái của cây hoa Gloxinia in vitro"
Các chồi Gloxinia đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung BA gồm 2, 4, 6, 8 mg/l. Sau thời gian 15 ngày nuôi cấy, tiến hành chiếu xạ từ 1 – 4 krad. Vì vậy thí nghiệm bao gồm 21 nghiệm thức, trong đó 20 nghiệm thức kết hợp liều xạ với nồng độ BA và 1 nghiệm thức đối chứng.
Nghiệm thức BA (mg/l) Liều lƣợng tia Gamma (krad) Thời gian xử lý (giây) 3.1 (ĐC) 0 0 0 3.2 0 1 23,14 3.3 2 1 23,14 3.4 4 1 23,14 3.5 6 1 23,14 3.6 8 1 23,14 3.7 0 2 66,89 3.8 2 2 66,89 3.9 4 2 66,89 3.10 6 2 66,89 3.11 8 2 66,89 3.12 0 3 110,63 3.13 2 3 110,63 3.14 4 3 110,63 3.15 6 3 110,63 3.16 8 3 110,63 3.17 0 4 154,37 3.18 2 4 154,37 3.19 4 4 154,37 3.20 6 4 154,37 3.21 8 4 154,37 Số nghiệm thức: 21
Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu trong mỗi bình: 4 Tổng số bình: 189
Tổng số mẫu: 756
Chỉ tiêu theo dõi: 15 ngày theo dõi 1 lần, theo dõi sự sinh trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro sau khi cấy chuyền và sau khi chiếu tia , gồm các chỉ tiêu sau:
Hệ số nhân chồi
Hệ số nhân chồi = tổng số chồi hình thành / tổng số mẫu đã cấy
Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ sống sót = (số cụm chồi còn sống / tổng số mẫu đã cấy)*100
Tần số biến dị
Tần số biến dị = (số chồi bị biến dị / số mẫu đã cấy)*100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh hƣởng của nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng BA đến đặc điểm hình thái
- Sự tăng trƣởng chiều cao - Chiều cao cụm chồi (cm)
(Đếm trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm) - Lá:
Quan sát và đếm số lƣợng cây bị biến dị lá
Tần số biến dị lá = (số cây bị biến dị lá / số cây quan sát)*100 Biến dị lá gồm những thay đổi về:
+ Màu sắc + Hình dạng + Kích thƣớc - Thân:
Quan sát thân cây và đếm số cây bị biến dị thân
Tần số biến dị thân = (số cây bị biến dị thân /số cây quan sát)*100 Biến dị thân gồm những thay đổi:
+ Thân to hay nhỏ + Thân cao hoặc thấp + Màu sắc của thân
Thí nghiệm 4: "Trồng thử nghiệm cây Gloxinia in vitro ngoài vườn ươm"
Các cây con ở mỗi thí nghiệm 1, 2, 3 đƣợc đem trồng với giá thể đất sạch. Thiết kế các thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, theo nghiệm thức của các thí nghiệm trƣớc.
a) Thí nghiệm 4a: các cây con đƣợc xử lý với tia γ từ 0 – 4 krad đƣợc bố trí nhƣ sau:
Số nghiệm thức: 5
Số cây ở mỗi nghiệm thức: 4 Tổng số cây đem trồng: 60
b) Thí nghiệm 4b: các cây con đƣợc xử lý BA với 0, 2, 4, 6, 8 mg/l đƣợc bố trí nhƣ sau:
Số nghiệm thức: 5 Số cây ở mỗi nghiệm: 4 Tổng số cây đem trồng: 60
c) Thí nghiệm 4c: các cây con đƣợc xử lý với BA ( 0, 2, 4, 6, 8 mg/l) và tia γ ( 0 – 4 krad) đƣợc bố trí nhƣ sau:
Số nghiệm thức: 21
Số cây ở mỗi nghiệm thức: 4 Tổng số cây đem trồng: 252
Các chỉ tiêu theo dõi: các chỉ tiêu đƣợc theo dõi 10 ngày/lần, gồm:
Tỷ lệ sống sót.
Tỷ lệ sống sót = (số cây sống sót / tổng số cây đem trồng)*100
Các chỉ tiêu về hình thái: lá, thân,…
Chiều cao cây (cm): đƣợc tính từ gốc đến đỉnh sinh trƣởng.
Tốc độ ra lá = (số lá lần sau - số lá lần trƣớc) / thời gian giữa 2 lần quan sát.
Kích thƣớc lá (cm): chiều dài và chiều rộng lá.
Tần số biến dị lá.
Nội dung 2: Khảo sát sự tạo củ in vitro của cây Gloxinia (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối tƣợng nghiên cứu, thời gian và địa điểm nghiên cứu, thiết bị dụng cụ dùng trong nghiên cứu, mẫu cấy đều giống nội dung 1.
3.5. Môi trƣờng nuôi cấy tạo củ in vitro
Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS của Murashige và Skoog (1962).
Các chất khác:
Đƣờng sucrose: 30 g/l hoặc 50 g/l
Agar: 7 g/l
pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8
3.6. Bố trí thí nghiệm tạo củ in vitro
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thiết kế thí nghiệm:
Cây hoa Gloxinia in vitro (đã đƣợc cấy chuyền 3 tháng), mẫu cấy là các chồi đơn cao khoảng 1 cm. Gồm 2 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 lên sự tạo củ cây Gloxinia in
vitro
Mẫu cấy nuôi trong môi trƣờng MS có nồng độ khảo sát sucrose 5 % có nồng độ KH2PO4 thay đổi
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu sáng đến sự tạo củ cây hoa
Gloxinia in vitro.
Mẫu cấy nuôi trong môi trƣờng MS chiếu sáng với cƣờng độ
có sucrose 3% khác nhau
Thí nghiệm 1: "Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 lên sự tạo củ cây Gloxinia
in vitro".
Các chồi Gloxinia in vitro đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS 5% sucrose, nồng độ KH2PO4 thay đổi. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí nhƣ sau:
Nghiệm thức Hàm lƣợng KH2PO4 (mg/l)
1.1 85
1.2 170
1.3 340
Ghi chú : môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có sucrose 5%
Số nghiệm thức: 4
Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu cấy trong mỗi bình: 5 Tổng số bình: 36
Tổng số mẫu: 180 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm 2: "Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự tạo củ cây hoa Gloxinia in vitro".
Các chồi Gloxinia đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS 3% sucrose và đƣợc chiếu sáng ở 1000 – 5000 lux. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức đƣợc bố trí nhƣ sau:
Nghiệm thức Cƣờng độ chiếu sáng (lux)
2.1 1000
2.2 2000
2.3 3000
2.4 4000
2.5 5000
Ghi chú : môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có sucrose 3%
Số nghiệm thức: 5
Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu cấy trong mỗi bình: 5 Tổng số bình: 45
Tổng số mẫu: 225
Chỉ tiêu theo dõi ở cả 2 thí nghiệm:
Chiều cao cây (cm): đo trƣớc khi cắt củ.
Tỷ lệ tạo củ (%) = (số cây tạo củ/ số mẫu đã cấy)* 100
Trọng lƣợng củ (g): đo trọng lƣợng tƣơi
Đƣờng kính củ (cm): đo khi củ còn tƣơi.
3.7. Xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của tia gamma và chất điều hòa sinh trưởng BA đến sự biến đổi kiểu hình của cây Gloxinia
4.1. Ảnh hƣởng của tia γ đến sự sinh trƣởng và biến đổi kiểu hình cây hoa Gloxinia in vitro Gloxinia in vitro
Chiều cao cây
Các cây con in vitro đƣợc chiếu xạ từ 1 – 4 krad. Tia gamma có thể kích thích hoặc không kích thích cây tăng trƣởng chiều cao tùy theo sự tƣơng tác của nó trên mô.
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến chiều cao của cây Gloxinia in vitro Nghiệm
Thức
Liều lƣợng tia γ (krad)
Chiều cao trung bình (cm) Trƣớc chiếu xạ 1 ngày Sau chiếu xạ 15 ngày 30 ngày 1.1 (ĐC) 0 1,21a 1,53a 2,09ab 1.2 1 1,28a 1,81b 2,75d 1.3 2 1,23a 1,83b 2,45c 1.4 3 1,29a 1,85b 2,27bc 1.5 4 1,26a 1,52a 1,95a
Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy sự khác biệt về chiều cao của cây Gloxinia in vitro trƣớc khi đem chiếu xạ là do sai số ngẫu nhiên. Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê là do ảnh hƣởng của liều chiếu xạ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ở thời gian 30 ngày sau khi chiếu xạ:
Liều xạ γ 1 krad cho thấy phù hợp với sự tăng trƣởng chiều cao của cây.
Nghiệm thức liều chiếu xạ 4 krad có chiều cao cây thấp nhất. Cây đối chứng và cây đƣợc chiếu xạ 4 krad không có sự khác biệt về chiều cao trên phƣơng diện thống kê học.
Giai đoạn này phát hiện đƣợc liều xạ thích hợp với cây Gloxinia. Kết quả khảo sát cho thấy liều lƣợng tia γ càng tăng thì chiều cao cây không tăng theo và chúng thực sự có tác động lên sự phát triển của cây.
Số lá của cây
Các cây con in vitro đƣợc chiếu xạ ở 1 – 4 krad. Số lá trung bình trên một cây không tỷ lệ thuận với sự tăng liều lƣợng tia γ. Tia γ có tác dụng kích thích hoặc ức chế việc ra lá của cây còn phải tùy thuộc vào mức độ gây ổn thƣơng trên mô, gene của nó.
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến số lá của cây Gloxinia in vitro Nghiệm Thức Liều lƣợng tia γ (krad) Số lá trung bình/cây Trƣớc chiếu xạ 1 ngày Sau chiếu xạ 15 ngày 30 ngày 1.1 (ĐC) 0 11,61a 16,44b 27,00b 1.2 1 11,67a 34,17e 38,00c 1.3 2 12,83a 27,17c 39,78c 1.4 3 11,78a 30,5d 38,72c 1.5 4 11,33a 14,28a 20,06a
Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả xử lí số liệu cho thấy số lá trung bình của cây Gloxinia in vitro trƣớc
khi đem chiếu xạ 1 ngày ở các nghiệm thức có sự sai số ngẫu nhiên; ở thời gian 15 và 30 ngày sau khi chiếu xạ giá trị trung bình của các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê.
30 ngày sau chiếu xạ
Số lá trung bình trên cây ở nghiệm thức liều xạ 1, 2, 3 krad cao hơn nghiệm thức đối chứng và giữa chúng không có sự khác biệt về mặt thống kê.
Nghiệm thức liều xạ 4 krad có số lá trên cây thấp nhất.
Liều xạ thấp nhất giúp cây ra lá nhiều hơn. Vì với liều lƣợng đó không gây chết mô cây, không làm ức chế quá trình trao đổi chất của cây và có tác động kích thích cây phát triển.
Liều xạ cao hơn có thể gây ra ức chế khi vừa tiếp xúc với mô cây. Do cây có những phản ứng phòng vệ khi có tác nhân tác động vào nó. Những phản ứng đó có thể có lợi cho cây hoặc ngƣợc lại tùy theo loại tác nhân. Bức xạ liều cao sẽ gây ra những biến đổi mạnh trên gene, tế bào cây trồng làm thay đổi đột ngột các phản ứng trong cây dẫn đến ức chế.
Tỷ lệ cây ra rễ
Khi không có sự tác động của tia γ thì cây ra rễ chậm. Cây đƣợc chiếu xạ 1 krad ra rễ sớm nhất.
Kết quả khảo sát liều chiếu xạ γ ảnh hƣởng đến tỷ lệ cây ra rễ nhƣ sau:
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến tỷ lệ cây ra rễ của cây Gloxinia in vitro Nghiệm Thức Liều lƣợng tia γ (krad) Tỷ lệ cây ra rễ (%) Sau chiếu xạ 15 ngày 30 ngày 1.1 (ĐC) 0 41,67a 83,33a 1.2 1 100,00b 100,00b 1.3 2 47,22a 100,00b 1.4 3 52,78a 100,00b 1.5 4 38,89a 100,00b
Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả xử lí số liệu cho thấy tỷ lệ cây ra rễ của cây Gloxinia in vitro có sự