2.3.1. Khái niệm
Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, đƣợc đặt trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh đƣợc phân chia và cấy chuyền để nhân giống.
2.3.2. Ứng dụng
Kỹ thuật này thể hiện một số ƣu điểm đã đƣợc ứng dụng:
Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh.
Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.
Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến.
Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn.
Lai xa qua nuôi cấy phôi và noãn.
Cải biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai.
Cố định nitrogen.
Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp.
Bảo quản nguồn gen quý.
Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật đƣợc ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Các vấn đề cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn trong môi trƣờng nhân tạo, nhu cầu về khoáng, vitamine, chất điều hòa sinh trƣởng, nguồn carbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng ngày càng đƣợc hiểu sâu sắc hơn.
2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy đốt đơn thân
Phƣơng pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ đƣợc kích thích cho tăng trƣởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn. Đây là phƣơng pháp tự nhiên nhất trong những phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro bởi vì có thể áp dụng đƣợc in vivo.
Chồi đƣợc thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trƣởng. Chồi mới tăng trƣởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục đƣợc cấy chuyền đến khi đạt đủ số lƣợng chồi cần thiết thì chúng đƣợc cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh và đƣợc chuyển ra trồng trong đất.
Nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy nốt đơn thân và cảm ứng rễ cho chồi đƣợc tiến hành trên cây măng tây (Galston, 1947, 1948; Gorter, 1965; Andreassen và Elison, 1967). Phƣơng pháp nuôi cấy nốt đơn thân đã đƣợc thực hiện thành công trên nhiều cây: khoai tây (Morel và Martin, 1955), lê (Quoirin, 1974), hoa hồng (Heliott, 1970)…Phƣơng pháp này cũng đƣợc áp dụng để nhân giống cà chua, dƣa chuột, cà tím (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.3.4. Phƣơng pháp nhân chồi bên
Về nguyên tắc phƣơng pháp này giống nhƣ phƣơng pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Điều khác nhau lớn nhất là trong phƣơng pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài của chồi, thân và thƣờng không cần đến cytokinin để phát triển.
Trong phƣơng pháp nhân chồi bên, chồi ngọn đƣợc cô lập trên môi trƣờng dinh dƣỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dƣới ảnh hƣởng của cytokinin với
nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ƣu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này đƣợc tiếp tục chuyển sang môi trƣờng mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục đƣợc tạo ra. Sau đó các chồi này đƣợc chuyển vào môi trƣờng ra rễ và đƣợc đƣa ra ngoài vƣờn ƣơm khi đã có rễ hoàn chỉnh.
Thực tế cả hai phƣơng pháp này thƣờng đƣợc áp dụng chung: đầu tiên, chồi tăng trƣởng bình thƣờng, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy để cảm ứng sự hình thành các chồi bên.
Phƣơng pháp nhân giống bằng chồi bên đầu tiên đƣợc tiến hành ở cây hoa cẩm chƣớng bởi Hackett và Anderson (1967), sau đó là Adams (1972) và Boxus (1973, 1974) tiến hành trên cây dâu tây, Pierik và công sự (1973, 1974, 1975), Murashige và cộng sự (1974) tiến hành trên cây cúc đồng tiền (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
Một số yếu tố quan trọng ảnh hưởng lên sự hình thành chồi bên
Nhu cầu về cytokinin rất khác nhau (loại và nồng độ cytokinin).
Nhu cầu cytokinin thay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy.
Phối hợp auxin ở nồng độ thấp với cytokinin ở nồng độ cao.
Sự cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.
Khi cấy chuyền nhiều lần, tốc độ tăng sinh chồi bị thay đổi.
Ngoài ra còn có các phƣơng pháp nuôi cấy khác nhƣ: nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nuôi cấy mô sẹo, phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy protoplast - chuyển gen, nuôi cấy tế bào đơn bội. Tùy theo loại cây và mục đích mà ngƣời ta chọn lựa phƣơng pháp nuôi cấy thích hợp, đem lại hiệu quả cao.
2.4. Vai trò của chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Chất điều hoà sinh trƣởng 2.4.1. Chất điều hoà sinh trƣởng
Chất sinh trƣởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dƣỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật.
Về đại cƣơng các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự
2.4.2. Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng
Hiện nay 5 nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc dùng: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh trƣởng.
Auxin
Auxin là một nhóm các chất đƣợc tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, đƣợc vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực.
Chức năng của auxin
- Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thƣớc của các cơ quan, ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào nhƣ cellolose, pectin… - Điều chỉnh tính hƣớng động của cây: quang hƣớng động và địa hƣớng
động.
- Gây ra hiện tƣợng ƣu thế ngọn đƣợc giải thích bằng việc ức chế sinh trƣởng của chồi bên khi auxin đƣợc vận chuyển từ ngọn xuống dƣới. - Kích thích sự hình thành rễ.
- Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm hãm sự rụng lá, hoa, quả.
- Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù.
Các phản ứng auxin và sự tăng trƣởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trƣng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993).
Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981) (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].
Cytokinin
Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trƣởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin nhƣ chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh…
Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. Cytokinin đƣợc sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
Đặc điểm của cytokinin
Cytokinin đƣợc vận chuyển trong cây không phân cực nhƣ auxin, có thể hƣớng ngọn và hƣớng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng nhƣ các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là ure.
Các cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và PBA.
Chức năng của cytokinin
- Vai trò sinh lý đặc trƣng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào.
- Ảnh hƣởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi.
- Kìm hãm quá trình hóa già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân hủy của diệp lục, protein và acid nucleic.
- Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa.
- Điều chỉnh hiện tƣợng ƣu thế ngọn.
- Ảnh hƣởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hƣởng đến các quá trình trao đổi chất.
- Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trƣởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bƣớu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991).
Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi
Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng nhƣ trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỷ lệ
thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhƣng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nƣớc.
Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì ngƣời ta thƣờng phối hợp cytokinin với auxin.
Nồng độ cytokinin cao (0,5 – 10 mg/l) thƣờng cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và cộng sự, 1991) đồng thời cản sự tăng trƣởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin (Humphries, 1960) (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì tùy vào mẫu cấy và yêu cầu của từng thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc dùng một cách hợp lý.
2.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1 Muối khoáng 2.5.1 Muối khoáng
Muối khoáng đƣợc tế bào cây sử dụng cho sự tổng hợp phân tử hữu cơ hay xúc tác các phản ứng enzyme. Những ion của muối hòa tan đóng vai trò quan trọng trong sự vận chuyển phân tử, điều hòa thẩm thấu và duy trì điện thế của cây trồng.
Nitơ, Phốtpho, Lƣu Huỳnh là thành phần của protein và acid nucleic. Magiê và một số vi lƣợng hình thành các phần chủ yếu của enzyme và cấu trúc tế bào, do đó xúc tác nhiều phản ứng khác nhau.
Canxi và acid boric đƣợc tìm thấy chủ yếu trong vách tế bào và Canxi có vai trò quan trọng trong sự ổn định màng sinh học.
Kali và Clo quan trọng trong sự điều hòa thẩm thấu, duy trì điện thế và hoạt tính enzyme.
Các nguyên tố đa lƣợng: N, P, K, S, Ca, Mg.
Các nguyên tố vi lƣợng: Fe, Cu, Mn, Co, B, I, Ni, Cl, Al (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].
Muối khoáng đa lượng
Nhu cầu của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các muối khoáng đa lƣợng cần cung cấp là muối Nitơ, Phốtpho, Canxi, Kali…
Nitơ thƣờng đƣợc dùng ở dạng Nitrat hoặc muối Amonium, Nitrit và Amoniac ít đƣợc dùng vì ở nồng độ thấp thì nó không đủ mà ở nồng độ cao thì nó gây độc. Phốtpho đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng mono hay dihydrogenphosphate Kali hay Natri. Một số dạng muối đƣợc sử dụng: NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4.
Canxi đƣợc cung cấp dƣới dạng muối Canxi Clorua: CaCl2.H2O hoặc CaCl2.2H2O. Cây trồng hấp thụ Ca ở dạng Ca2+.
Sự dƣ thừa hay thiếu hụt các chất khoáng đa lƣợng đều có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro, đôi khi còn có tác động đến hình thái của
mẫu cấy (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].
Muối khoáng vi lượng
Welander (1977) đã đƣa ra những bằng chứng cho thấy tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần nhiều khoáng vi lƣợng. Các nguyên tố khoáng vi lƣợng có thể có ảnh hƣởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (Beasley và cộng sự, 1974).
Sắt đƣợc đƣa vào môi trƣờng dƣới dạng muối vô cơ (FeCl3, FeSO4). Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu cho thấy sắt đƣợc dùng dƣới dạng Chelat kết hợp với Na2 – EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng từ từ ra môi trƣờng theo nhu cầu của mô thực vật. Sự hiện diện của nguyên tố Fe đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Legrand, 1975).
Muối khoáng vi lƣợng thƣờng dùng là Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Cobalt (Co), Boron (B), Idodine (I), Molypden (Mo)… Một số muối vi lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng là ZnSO4, CuSO4, MnSO4, CoCl2, KI…
2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn carbon
Trong môi trƣờng nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dƣỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đƣờng để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là sucrose, d – glucose,
d – fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon đƣợc sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trƣởng và yêu cầu thí nghiệm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.5.3. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dƣỡng khác nhau. Thông thƣờng thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trƣởng và phát triển của chúng. Khi tế bào và mô đƣợc nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Vì vậy chỉ có một số vitamin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol.
Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trƣởng của tất cả các tế bào. Các vitamin khác nhƣ Vitamin H, C, E đôi khi đƣợc thêm vào. Vitamin C đôi khi đƣợc dùng ở nồng độ cao nhƣ là một chất chống oxy hóa. Myo-inositol có ý nghĩa cải thiện các phản ứng in vitro và tăng trƣởng của cây trồng, đặc biệt ở cây đơn tử diệp
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8].
2.5.4. Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định
Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trƣởng của mô. Các chất bổ sung có nhiều loại nhƣ: nƣớc cam, nƣớc cà chua, khoai tây, chuối… Hiện nay, chất bổ sung đƣợc dùng phổ biến là nƣớc dừa.
Ảnh hƣởng của nƣớc dừa
Nƣớc dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trƣờng với lƣợng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng nhƣ sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978).
Từ việc sử dụng nƣớc dừa, nhiều mô thực vật đƣợc nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi nhƣ nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nƣớc chiết cà chua… Nhƣng thông thƣờng các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002).
Hoạt tính của nƣớc dừa khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế đƣợc BAP. Van Overbeek và csv (1941) cho thấy nƣớc dừa kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà độc dƣợc (Datura solanaceae) trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong nƣớc dừa giàu các