phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Chúng tôi tiến hành biến nạp thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt, nồng độ khả nạp và plasmid. Nhằm xác định quy trình nào có hiệu quả nhất để phục vụ cho biến nạp plasmid tái tổ hợp.
Mỗi quy trình lập lại với thời gian sốc nhiệt là 60 giây, 90 giây
Quy trình 1
Hút 30µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 µl, thêm 3µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút
Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút Thêm 800µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ
Hút 150ml dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh Ampicilyn nồng độ 50µg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370
C.
Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào khả nạp để làm đối chứng.
Quy trình 2
Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút
Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ.
Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng.
Quy trình 3
Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút.
Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420
C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ.
Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng.