- Luận văn được thực hiện từ 13/3/2007 đến ngày 15/9/2008.
3.2.3. Đối tƣợng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là các loài vi khuẩn nội sinh trong mô thực vật ở keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium)
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
- Thu thập mẫu bệnh và mô tả triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai
- Phân lập mẫu bệnh
- Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm - Giám định nguyên nhân gây bệnh
- Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
trên môi trường dinh dưỡng PDA
- Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.
3.3.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh 3.3.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
- Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh - Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực.
3.3.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai
- Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm
- Thử nghiệm hiệu lực của khuẩn nội sinh trong phòng thí nghiệm
- Thử nghiệm hiệu lực của khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh ngoài vườn ươm.
- Ứng dụng hiệu lực khuẩn đối với rừng non keo lai 1 tuổi
- Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây keo lai ở giai đoạn rừng trồng non (1 tuổi).
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
3.4.1.1. Thu thập mẫu bệnh và mô tả triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai
Chọn các cây keo lai có triệu trứng bệnh, thể hiện về mặt hình thái đầu tiên lá đốm nhỏ sau vết đốm to dần lên, lá bị cháy và chết từ trên ngọn xuống. Cây vừa mới bị bệnh càng tốt. Lấy 15 mẫu, bọc mẫu bằng giấy báo cho vào túi ni lông để đem về phòng thí nghiệm.
Quan sát triệu chứng bằng mắt thường hoặc kính lúp các đặc điểm bên ngoài của thân, cành, lá bị bệnh như biến đổi về màu sắc chỗ thân cành bị bệnh, bệnh trạng, sự phân bố bệnh trạng trên thân cành. Mô tả và chụp ảnh thân, cành, lá bị bệnh.
Trong trường hợp cơ quan sinh sản của vật gây bệnh chưa xuất hiện thì có thể dùng phương pháp giữ ẩm của Naumov, mẫu thân cành bị bệnh để trong hộp petri có giấy hút ẩm để vật gây bệnh hình thành cơ quan sinh sản.
Đối với trường hợp trên thân cành, lá xuất hiện cơ quan sinh sản có thể lấy trực tiếp vật gây bệnh trên mẫu bệnh.
3.4.1.2. Phân lập mẫu bệnh
Có 2 phương pháp phân lập:
Phương pháp 1: Phân lập trực tiếp trên môi trường PDA.
Lấy phần thân bị bệnh của cây keo, tiến hành rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 700
rồi rửa lại 2 - 3 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi đã khử trùng mẫu bệnh xong thì cắt thành từng đoạn nhỏ 5 -
7(cm) rồi cấy trên môi trường PDA được đựng trong hộp lồng. Đặt các hộp lồng đã cấy mẫu bệnh này trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280
C trong khoảng 2 - 3 ngày để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi trường. Khi nấm đã mọc ra ngoài môi trường PDA ta tiến hành cấy chuyển nấm này sang các hộp lồng khác có chứa PDA để thuần khiết nấm bệnh.
Phương pháp 2: Để trong hộp lồng ẩm.
Lấy cành bị bệnh cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 5 - 7 cm cho vào hộp lồng đã được làm ẩm (dùng hộp lồng đã được khử trùng, sau đó để giấy ẩm vào trong) hộp lồng cần có độ ẩm thích hợp không được ẩm quá cũng như khô quá (để tạo môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm bệnh), tiếp theo dùng băng keo quấn 2 đến 3 vòng, để hộp lồng trong vòng 2 - 3 ngày thấy trên cành được làm ẩm, xuất hiện các vết bệnh màu đen, để hộp lồng càng lâu ngày thì cành làm ẩm càng đen là do sự phát triển của nấm bệnh (lưu ý cành được làm ẩm phải là cành có vết bệnh, nếu vết bệnh càng mới thì càng tốt, thường ta lấy cành làm ẩm ở cấp bệnh từ II - IV.
Khi đã thấy sự phát triển của nấm bệnh thì tiến hành cấy nấm trên môi trường PDA, cách cấy như sau: Trước tiên đưa hộp lồng có chứa cành làm ẩm lên kính hiển vi soi để tìm sợi nấm bào tử, dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới.
3.4.1.3. Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo là phương pháp kiểm tra và khẳng định được loài nấm phân lập từ các tổ chức bị bệnh trên thân, cành có chính xác hay không.
Phương pháp thí nghiệm: Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm bằng que cấy inox được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng pha loãng tới hạn đến mật độ khoảng 1.106
hành nhúng các mẫu lá keo vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi thời gian bệnh xuất hiện và kiểm tra bào tử nấm trên các lá gây bệnh nhân tạo.
3.4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh
Căn cứ vào nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử quan sát trên kính hiển vi và tham khảo, đối chiếu với các tài liệu phân loại Zhao Liping (1983), F.G. Brown (1968) và Sutton B. (1980) đ ể xác định loại nấm gây bệnh.
3.4.1.5. Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides
(Penz.) Sacc. trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA
Nghiên cứu sự sinh trưởng của sợi nấm được tiến hành trên môi trường dinh dưỡng PDA. Sau khi cấy nấm, nuôi nấm trong tủ định ôn với nhiệt độ 280C. Đo đường kính phát triển nấm sau 24 giờ; 48 giờ và 72 giờ theo 2 chiều vuông góc.
3.4.1.6. Đánh giá ảnh hƣởng mức độ của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
Mục đích là để nắm vững tình hình phân bố, mức độ bị hại đồng thời nghiên cứu mối quan hệ giữa vật gây bệnh và cây chủ.
Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh, hướng phơi khác nhau... lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m2 (40 m x 25 m), (dung lượng mẫu điều tra n 30). Sau khi điều tra trên ô tiêu chuẩn tỷ lệ và mức độ bị bệnh được tính toán như sau:
* Điều tra tỷ lệ bị bệnh (P%)
Trong mỗi ô tiêu chuẩn, đếm tổng số cây điều tra và số cây bị bệnh thân, cành hoặc lá trong ô. Tỷ lệ bị bệnh trong ô tiêu chuẩn được tính theo công thức như sau: P = x100 N n [3.01] Trong đó: P là tỷ lệ bị bệnh (%). n là số cây bị bệnh
N là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn
Nếu : 0 < P < 5% Phân bố cá thể 5% ≤ P < 25% Phân bố cụm
25% ≤ P <50% Phân bố đám P ≥ 50% Phân bố đều
* Mức độ bị bệnh:
Điều tra toàn bộ số cây trong ô tiêu chuẩn (dung lượng mẫu n 30). Sau đó tiến hành điều tra ở toàn bộ thân, cành và tán của cây. Căn cứ vào diện tích bị hại ở thân, cành và lá để phân cấp bệnh, tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4. Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại theo Nguyễn Hoàng Nghĩa và Phạm Quang Thu năm 2006 [13].
Mức độ bị hại Cấp bệnh Biểu hiện bên ngoài
Không bị bệnh 0 Cây khoẻ, tán lá phát triển bình thường (Hình 3.01)
Hại nhẹ 1 Dưới 25% tán lá bị bệnh hoặc dưới 10% cành bị bệnh. (Hình 3.02)
Hại trung bình 2 25 - 50% tán lá bị bệnh hoặc 10 - 25% cành bị bệnh. (Hình 3.03)
Hại nặng 3 > 50 - 75% tán lá bị bệnh hoặc > 25 - 50% cành bị bệnh. (Hình 3.04)
Hại rất nặng 4 > 75% tán lá bị bệnh hoặc trên 50% cành b ị bệnh. (Hình 3.05)
Hình 3.01: Cây bị bệnh cấp 0
(cây khỏe, không bị bệnh)
Hình 3.02: Cây bị bệnh cấp 1 Hình 3.03: Cây bị bệnh cấp 2
Mức độ bị bệnh được tính bình quân gia quyền theo số cây ở các chỉ số bệnh trong ô tiêu chuẩn.
Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh
Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh Cấp 2: > 10 - 20% diện tích lá bị bệnh Cấp 3: > 20 - 30% diện tích lá bị bệnh Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh.
- Tính mức độ bị bệnh chung cho mỗi chủng khuẩn.
R = 1 . . i ni vi N V x100% [3.02] Trong đó: R: Là mức độ bị bệnh (Severity of attack)
ni: Là số cây bị bệnh theo cấp bệnh i. vi: Là chỉ số của cấp bệnh i.
n: Là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn. V = 4.
- Mức độ bị bệnh của toàn khu vực điều tra được tính theo công thức:
Rtb = Ri
n [3.03]
Trong đó: Rtb là mức độ bị hại của toàn khu vực điều tra. Ri là mức độ bị hại của từng ô tiêu chuẩn.
n là tổng số ô tiêu chuẩn.
- Chỉ số tổn thất được xác định thông qua công thức sau: DI (%) = R% x P% [3.04] Trong đó:
R (%) mức độ bị bệnh P (%) tỷ lệ bị bệnh
Căn cứ vào trị số DI xác định được biện pháp phòng trừ:
0,1 ≤ DI < 0,25 cần loại bỏ lá, thân cành bệnh và phun thuốc phòng trừ
0,25 ≤ DI < 0,5 cần cắt bỏ lá và thân cành bệnh, loại bỏ cây bệnh nặng và phun thuốc phòng trừ DI ≥ 0,5 chặt bỏ cây bệnh
3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh
Trên các khu rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, Thanh Sơn, Phú Thọ tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4. Ở mỗi cấp bệnh khác nhau cần phải chọn ra 3 cây đặc trưng và tiêu biểu, mỗi cây lấy một mẫu (một cành) có đường kính 1 - 1,5 cm. Các cành được chọn có vị trí cành ít được chiếu sáng và đánh ký hiệu riêng cho từng cành.
Phƣơng pháp phân lập
Bƣớc 1: Chuẩn bị dụng cụ
Rửa hộp lồng cho sạch sau đó để khô bọc kín bằng giấy báo và cho vào nồi hấp khử trùng ở 1210C tương đương với áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút. Sau đó cho vào tủ sấy đặt ở nhiệt độ 1100
C để qua đêm.
Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng
Để phân lập vi khuẩn nội sinh cần chuẩn bị một số loại môi trường sau:
Môi trƣờng PBS: NaCl : 8,5 gam KH2PO4 : 6,8 gam NaOH : 1,16 gam Nước cất : 1000 ml Điều chỉnh pH : 7
cần phải nút bông chặt và miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy, mỗi ống nghiệm là 9ml: hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 30 phút .
Môi trƣờng PDA:
Khoai tây : 200 gam
D-Glucose : 20 gam
Agar : 15-18 gam Nước cất :1000ml
Khoai tây rửa sạch cắt thành miếng có kích thước 1x1x1cm cho vào nồi và đổ nước 1000 ml đun sôi, để 30 phút tính từ lúc sôi, lọc lấy nước trong, sau đó cho thêm nước cho đủ 1000 ml. Cho D-glucose và agar vào các bình tam giác 500 ml nút bông, quấn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330 ml). Hấp khử trùng ở môi trường 1210C trong 30 phút rồi đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy.
Môi trƣờng nƣớc cất
Rửa sạch các ống nghệm cho 9 ml nước vào các ống nghiệm nút bông vào miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy. Cho vào nồi hấp khử trùng ở môi trường 1210
C (tương đương với 1atm) trong 30 phút.
Bƣớc 3: Cắt mẫu
Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7- 8 cm, khử trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0 (mm) ở 3 vị trí: phần vỏ (Bark) ký hiệu là B; phần tượng tầng (Phloem) ký hiệu là P; phần gỗ (Xylem) ký hiệu là X.
Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống nghiệm có chứa môi trường PBS nút bông và bịt miệng ống nghiệm bằng giấy để qua đêm. Nếu phần tượng tầng của mẫu bệnh quá ít ta có thể lấy 0,5 gam của phần tượng tầng cho vào ống nghiệm chứa 4,5 ml môi trường PBS.
Bƣớc 4: Phân lập vi khuẩn nội sinh
Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn. Dùng pipet lấy 0,1ml cho vào hộp lồng có chứa môi trường PDA, dùng que trang đều trên mặt thạch và ghi rõ ngày cấy và ký hiệu mẫu bệnh. Để các hộp lồng đã cấy vi khuẩn trong tủ định ôn với nhiệt độ 280C, theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm số lượng vi khuẩn có trong hộp lồng, có bao nhiêu chủng khác nhau, mô tả đặc điểm của mỗi chủng. Nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều trên mỗi hộp lồng cần pha loãng đến 105
, 106. Dùng que cấy tách ra từng chủng vi khuẩn khác nhau rồi cho ra một hộp lồng khác có chứa môi trường PDA (mỗi hộp một loại vi khuẩn), mỗi chủng cấy 2 hộp lồng, sau đó dùng băng keo quấn chặt.
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn, mô tả đặc điểm của vi khuẩn khi nó được tách ra.
Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước để nhận biết các loại vi khuẩn khác nhau và được thống kê các chủng phân lập được từ các mẫu thí nghiệm.
3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
3.4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh
- Xác định các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm gây bệnh
Sau phân lập được vi khuẩn thuần khiết chúng ta cấy nấm gây bệnh ở 3 góc của hộp lồng và cuốn kín hộp lồng rồi ghi rõ ngày tháng trên nắp hộp lồng giữ mẫu ở tủ định ôn.
Sau 5 - 7 ngày thì tiến hành đánh giá hiệu lực của vi khuẩn đối với nấm gây bệnh trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế.
Công thức đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh được tính bằng công thức:
Trong đó: V (mm): đường kính trung bình vòng ức chế.
D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của hộp lồng đến mép trong của khuẩn lạc nấm bệnh.
d (mm): đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn tính theo hai chiều vuông góc.
Căn cứ vào trị số V, xác định được chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm gây bệnh loét thân cành keo lai. Trị số V càng lớn, chủng vi khuẩn càng có hiệu lực mạnh. Những chủng khuẩn có hiệu lực đường kính trung bình vòng ức chế (V ≥ 20 mm).
- Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao
Lấy 1ml dung dịch khuẩn của các chủng có hiệu lực kháng nấm cao pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn.
Lấy 0,1 ml dịch khuẩn đã pha loãng trang trên các hộp lồng chứa môi