RƯỢU VANG
Do có nhiều ưu điểm lớn, kỹ thuật cố định ngày càng được nghiên cứu rộng rãi và cho thấy có nhiều ưu thế trong sản xuất rượu vang. Kỹ thuật cố định được ứng dụng trong sản xuất rượu vang trong một số lĩnh vực sau:
2.4.1 Dùng kỹ thuật cố định để khắc phục một số vấn đề trong sản xuất rượu vang sản xuất rượu vang
2.4.1.1Loại acid trong rượu vang
L-malic acid là một hợp chất tự nhiên có trong nho, hàm lượng của nó trong nho thay đổi tùy thuộc vào chủng loại nho và điều kiện thời tiết. Acid malic có vị chua gắt rất khó chịu, do đó, để nâng cao giá trị cảm quan của rượu vang, người ta tiến hành loại acid malic trong dịch lên men.
Tuy nhiên, cần phải lưu ý rằng, quá trình loại acid malic không phải là thích hợp cho tất cả các loại rượu vang. Quá trình này chỉ thích hợp cho các loại rượu vang lên men từ dịch nho có độ acid cao. Còn đối với dịch nho có độ acid thấp, quá trình loại acid malic làm giảm tính acid, gây ra những ảnh hưởng có hại đến độ ổn định về mặt vi sinh và tính chất cảm quan của rượu vang [7].
Phương pháp phổ biến nhất để loại acid malic là phương pháp lên men malolactic. Quá trình lên men malolactic có tác dụng chuyển hóa acid malic thành acid lactic, góp phần làm giảm độ chua và làm tăng nhẹ giá trị pH của rượu vang. Khi đó, màu của rượu vang sẽ bị thay đổi do pH tăng và có sự thay đổi của các hợp chất phenol như là tannin và anthocyanin. Quá trình này gây ra bởi hệ vi khuẩn lactic mà phổ biến nhất là Oenococcus oeni và một số vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus và Pediococcus. Quá trình lên men malolactic thường xảy ra vào cuối giai đoạn lên men cồn của nấm men và nó bị ảnh hưởng rất nhiều dưới tác động của các yếu tố môi trường như pH, nồng độ cồn, hàm lượng SO2, nhiệt độ, đường sót, lysosyme, biotin, thiamine, các hợp chất phenol và sự có mặt của bacteriophages. Quá trình lên men malolactic không diễn ra khi hàm lượng SO2 cao hơn 100mg/L, hoặc khi pH nhỏ hơn 2,9, và nó sẽ bị chậm hoặc hoãn lai khi nhiệt độ lên men nhỏ hơn 15oC hoặc khi hàm lượng cồn vượt quá 10%. Nhìn chung, môi trường dịch nho không phải là môi trường thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển và quá trình lên men malolactic thực chất rất khó điều khiển [21, 113, 120, 123, 128, 160, 163, 212].
Tuy nhiên, sử dụng tế bào cố định có thể giải quyết được vấn đề khó khăn trên do tế bào cố định có khả năng chịu được sự ức chế của cồn, pH thấp và SO2 cao. Kosseva và cộng sự (1998) đã sử dụng O. oeni cố định trong gel Ca-pectate để lên men malolactic vàkết quả cho thấy tốc độ khử acid malic bởi tế bào cố định cao gấp 2 lần so với tế bào tự do [113].
Bên cạnh phương pháp lên men malolactic còn có một phương pháp khác là phương pháp chuyển hóa acid malic thành cồn nhờ nấm men Schizosaccharomyces pombe. Phương pháp này có ưu điểm hơn phương pháp malolactic ở chỗ nấm men Schizosaccharomyces
pombe có khả năng phát triển trong môi trường pH thấp và hàm lượng SO2 cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy nếu nấm men Schizosaccharomyces pombe sống trong môi trường lên men quá lâu sẽ tạo các hợp chất hương gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu vang. Thông thường, người ta tiến hành xử lý dịch nho với
Schizosaccharomyces pombe trước, sau đó sẽ tách nấm men ra và tiến hành hoàn tất quá trình lên men bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae. Việc loại nấm men
Schizosaccharomyces pombe ra khỏi dịch lên men sau khi đã chuyển hóa acid malic là rất cần thiết. Công việc này gây tốn kém và không hiệu quả do rất khó loại toàn bộ nấm men
Schizosaccharomyces pombe ra khỏi dịch lên men bằng các phương pháp lọc thông thường. Việc sử dụng nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định để chuyển hóa acid malic được coi là một giải pháp cực kỳ hữu hiệu vì nó khắc phục được toàn bộ các nhược điểm nêu trên [126, 168, 212, 180].
Magyar và cộng sự (1989) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát loại acid malic trong rượu vang sử dụng nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định trong gel alginate. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định trong gel alginate cho hiệu quả loại acid malic cao hơn so với sử dụng nấm men tự do (Hình 2.23). Kết quả phân tích hóa học và cảm quan sản phẩm sau khi lên men cho thấy sản phẩm tạo thành từ các quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định có chất lượng cao hơn hẳn sản phẩm tạo thành từ quá trình lên men rượu vang không sử dụng nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định [126].
Hình 2.23: Sự chuyển hóa acid malic bởi nấm men tự do và nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định khi sử dụng các hàm lượng đường ban đầu khác nhau[126].
Một nghiên cứu khác của Yokotsuka và cộng sự (1993) về điều khiển đồng thời quá trình loại acid và quá trình lên men cồn từ dịch nho có hàm lượng acid cao sử dụng 2 loại nấm men cố định trong gel alginate là Schizosaccharomyces pombe và Saccharomyces cerevisiae cũng cho kết quả rất khả quan. Nhờ sự có mặt của nấm men
Schizosaccharomyces pombe mà hàm lượng acid tổng trong dịch lên men giảm đáng kể. Do nấm men cố định có thể tách ra khỏi dịch lên men một cách dễ dàng nên
Schizosaccharomyces pombe được tách ra khỏi dịch lên men sau quá trình chuyển hóa acid malic nên không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Đồng thời, quá trình lên men cồn truyền thống vẫn được thực hiện nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định. Chính vì vậy, chất lượng của rượu vang không hề thua kém mà đôi khi còn có chất lượng cao hơn rượu vang lên men bằng nấm men tự do [212].
Silva và cộng sự (2003) đã tiến hành loại acid trong rượu vang bằng cách sử dụng nấm men Schizosaccharomyces pombe cố định trong gel alginate 2 lớp. Kết quả cho thấy khả năng lên men của nấm men cố định tương tự với nấm men tự do, và các hạt nấm men cố định có thể tái sử dụng trong vòng 5 chu kỳ mà không làm giải phóng tế bào vào trong dịch lên men [180].
2.4.1.2Ngăn chặn hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao
Hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao có thể xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau (bảng 2.10), làm giảm quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men và do đó làm giảm sự tạo thành sinh khối, khả năng sống của tế bào và tốc độ lên men [85].
Bảng 2.10: Các nguyên nhân cơ bản gây ra hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao[85, 170, 26, 163]
Thiếu dinh dưỡng Nitơ
Các chất khoáng Vitamin
Oxy
Ergosterol và các acid béo không no
Tác động của các chất ức chế Ethanol
Các acid độc (MCFA – Medium chain fatty acid) Sulphite
Dư lượng thuốc trừ sâu
Sự đối kháng giữa các vi sinh vật Nấm mốc
Vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic Nấm men dại
Điều kiện lên men Nhiệt độ không thích hợp (quá cao hoặc quá thấp) Hàm lượng đường cao
Tỷ lệ fructose : glucose cao pH thấp
Để khắc phục hiện tượng này, có thể dùng các cách sau:
−Cung cấp thêm chất dinh dưỡng (ammonium phosphate, chất chiết nấm men) [163].
−Cấy lại bằng nấm men mới [163].
−Hấp phụ các acid béo lên than hoạt tính [163].
Tuy nhiên, cách tốt nhất vẫn là sử dụng nấm men cố định để cấy vào môi trường đang bị ùn tắc. Silva và cộng sự (2002) đã sử dụng toàn bộ tế bào S. cerevisiae nhốt trong gel Ca- alginate để xử lý hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao trong sản xuất rượu vang ở Pháp và Bồ Đào Nha. Các tế bào cố định cho thấy có kết quả tốt hơn so với tế bào tự do. Các tế bào cố định đạt được tốc độ hấp thu đường khử khoảng 2,8g/L trong một ngày với mật độ 5tr tế bào/mL và không làm tăng hàm lượng acid dễ bay hơi cũng như các hương vị không ưa thích [179].
2.4.2Dùng kỹ thuật cố định trong một số phương pháp lên men Như chúng ta đã biết, quá trình lên men rượu vang theo phương pháp truyền thống là quá trình lên men tĩnh sử dụng nấm men tự do. Quá trình lên men và thiết bị lên men trong trường hợp này tương đối đơn giản, tuy nhiên, việc tối ưu hóa và tự động hóa quá trình rất khó khăn, đồng thời khả năng tái sử dụng của nấm men tự do là rất thấp. Khi ứng dụng nấm men cố định vào quá trình lên men rượu vang, ta có thể khắc phục các nhược điểm này bằng phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ (để tái sử dụng nấm men) và lên men liên tục (để tự động hóa quá trình lên men).
2.4.2.1Lên men tĩnh nhiều chu kỳ
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nấm men cố định có khả năng tái sử dụng ở nhiều chu kỳ lên men mà vẫn duy trì được hoạt tính lên men và chất lượng rượu vang cao:
−M. Iconomopoulou và cộng sự (2002) đã nghiên cứu khả năng ứng dụng của nấm men cố định sấy thăng hoa (FGB) trong công nghiệp và nhận thấy rằng tuy ở chu kỳ 1, thời gian lên men và năng suất lên men không có sự khác biệt so với nấm men tự do (ffdc) nhưng ở chu kỳ 2, nấm men cố định cho năng suất lên men cao hơn hẳn và tốc độ lên men tăng lên đáng kể (Hình 2.24) [93].
−Bardi và cộng sự (1997) đã lần lượt cố định nấm men trên 2 loại chất mang là DCM và gluten để sử dụng cho quá trình lên men tĩnh nhiều chu kỳ tại các nhiệt độ khác nhau. Kết quả cho thấy nấm men cố định trên DCM có thể sử dụng trong 43 chu kỳ, trong khi đó, nấm men cố định trên gluten có thể sử dụng trong 29 chu kỳ. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khi sử dụng nấm men cố định để tiến hành lên men thì hàm lượng ethyl acetate tạo thành cao gấp 2 – 4 lần so với nấm men tự do, còn khi sử dụng nấm men cố định trên DCM để lên men ở nhiệt độ thấp thì hàm lượng amyl alcohol thấp hơn nhiều so với nấm men tự do, nhờ vậy mà giảm được độc tính cho sản phẩm rượu vang. Như vậy, sử dụng nấm men cố định sẽ cải thiện hương vị tốt hơn so với nấm men tự do [20].
Hình 2.24: Động học của quá trình lên men rượu vang ở những nhiệt độ khác nhau sử dụng nấm men cố định trên gluten. Dịch nho có nồng độ chất khô ban đầu là 204g/L, sử dụng nấm men cố định trên gluten sấy thăng hoa (FGB 1,2), nấm men tự do sấy thăng hoa (ffdc) (các chữ số 1 và 2 là lên men lặp lại lần thứ nhất và lần thứ 2)[93]
−Kourkoutas và cộng sự (2003) đã sử dụng nấm men cố định trên miếng mộc qua để lên men rượu vang theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ. Và kết quả cho thấy rằng quá trình lên men vẫn có thể tiếp tục trong khoảng 8 tháng mà không làm mất đi đáng kể hoạt tính của nấm men. Khi thực hiện lên men ở nhiệt độ rất thấp (< 10oC) thì quá trình lên men rượu vang hoàn thành chỉ trong vòng 4 ngày, ngắn hơn rất nhiều so với phương pháp lên men truyền thống. Còn nếu lên men ở 0oC thì thời gian cần thiết khoảng là 50 ngày. Năng suất sinh tổng hợp ethanol thì cao hơn ít nhất là 4 hoặc 5 lần so với quá trình lên men truyền thống. Bên cạnh đó, hương vị của sản phẩm cũng được cải thiện nhiều, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp [27]. Như vậy, quả mộc qua đã chứng tỏ là chất mang thích hợp cho quá trình sản xuất rượu vang, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp. Kết quả nghiên cứu của Kourkoutas và cộng sự (2001) khi cố định trên miếng táo cũng cho kết quả tương tự, với thời gian sử dụng khoảng 7 tháng mà không làm mất đi hoạt tính [110].
−Tsakiris và cộng sự (2004) đã tiến hành lên men rượu vang trắng sử dụng nấm men cố định trên nho khô theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ và kết quả cho thấy rượu vang tạo thành có hàm lượng acid dễ bay hơi, methanol và acetaldehyde thấp, và nấm men cố định có độ bền sinh học trong khoảng 4 tháng [196]. Một nghiên cứu khác của Tsakiris và cộng sự (2004) cũng cho thấy hệ thống lên men sử dụng nấm men cố định trên nho khô có độ bền vận hành rất cao, có thể tiến hành quá trình lên men tĩnh nhiều chu kỳ trong khoảng 1 năm mới phải thay nấm men cố định [197].
Ngoài ra, nấm men cố định còn có thể bảo quản trong một thời dài để sử dụng cho các chu kỳ lên men sau mà vẫn duy trì được hoạt tính lên men tốt. Kourkoutas và cộng sự (2003) đã khảo sát khả năng bảo quản và tái sử dụng của nấm men cố định trên miếng táo, kissiris và γ-alumina cho quá trình lên men rượu vang tại nhiệt độ thường theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ. Những kết quả đã cho thấy rằng nấm men cố định có thể hoạt
hóa lại và lên men sau một khoảng thời gian bảo quản tăng đáng kể so với nấm men tự do. Nấm men cố định trên táo và kissiris có thời gian sống sót lâu hơn (lần lượt là 40 và 50 ngày) so với nấm men cố định trên γ-alumina và nấm men tự do. Nếu sử dụng môi trường tổng hợp để bảo quản thì thời gian bảo quản có thể lên đến 6 tháng, nhờ đó có thể thực hiện hiệu quả việc bảo quản mà không cần làm lạnh hoặc sấy thăng hoa. Các kết quả cũng cho thấy rằng không có ảnh hưởng bất lợi đến thành phần các hợp chất hương tạo thành trong suốt quá trình bảo quản [105, 108].
2.4.2.2Lên men liên tục
Với mục tiêu không ngừng cải tiến nhằm mục đích giảm thiểu chi phí một cách tối đa cho sản xuất, tăng năng suất và chất lượng sản phẩm, phương pháp lên men liên tục đã được nghiên cứu rất rộng rãi trong thời gian qua trong lĩnh vực sản xuất đồ uống có cồn. Trong sản xuất rượu vang, phương pháp này cũng được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt là trong những năm gần đây. Nấm men sử dụng trong phương pháp lên men liên tục là nấm men cố định [13, 14, 94, 107, 127]:
−Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành lên men liên tục rượu vang tại nhiệt độ thấp và nhiệt độ phòng sử dụng lần lượt 3 chất mang là kissiris, γ-alumina và calcium alginate. Kết quả cho thấy rằng, mặc dù cùng sử dụng nấm men cố định nhưng năng suất sinh tổng hợp cồn khi lên men theo phương pháp liên tục cao hơn so với phương pháp lên men tĩnh (bảng 2.11) [14].
Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dịch nho bởi nấm men cố định trên kissiris,
γ-alumina và alginate tại 7, 13 và 27oC[14]
Nhiệt độ (oC)
Lên men tĩnh Lên men liên tục
Kissiris γ-alumina Alginate Kissiris γ-alumina Alginate 27 13 7 17,3 5,8 1,5 48,6 13,7 4,5 60,3 15,8 5,6 73,4 22,8 16,7 68,5 19,9 13,8 80,6 30,0 23,2
−Kourkoutas và cộng sự (2002) đã thực hiện quá trình lên men rượu vang liên tục sử dụng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ưa lạnh cố định trên miếng táo. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng năng suất lên men theo phương pháp này cao hơn nhiều so với phương pháp lên men tĩnh truyền thống. Năng suất lên men cồn ở 5oC thì bằng với năng suất lên men cồn ở 22 – 25oC theo phương pháp truyền thống. Bình lên men có thể vận hành liên tục trong vòng 95 ngày mà không làm giảm năng suất tạo cồn. Đồng thời, hàm lượng rượu bậc cao và acetaldehyde trong rượu vang này thì thấp hơn so với rượu vang lên men theo phương pháp lên men tĩnh truyền thống (bảng 2.12). Điều đó chứng tỏ rằng chất lượng rượu vang đã được cải thiện [112]. Một nghiên cứu khác của Kourkoutas và cộng sự