3. Ý nghĩa của ñề tài
2.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum
Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum dựa trên nồng ñộ IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng ñộ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng ñộ IAA ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm [27].
* Phương pháp xác ñịnh phương trình ñường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng ñộ IAẠ
- Chuẩn bị dung dịch ñệm phosphat ( 200ml) A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;
B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa ñủ 200ml, ñiều chỉnh pH 7. - Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất ñủ 1 lít, ñể nguội sau 12 giờ ñược dung dịch H2SO4 ñậm ñặc 10,8M.
Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M ñã pha ở trên ñể ñược thuốc thử Salkowskị
- Chuẩn bị ñường chuẩn IAA
Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch ñệm phosphat ñược nồng ñộ là 160mg/l. Sau ñó tiến hành pha loãng ra các nồng ñộ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l.
Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng ñộ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng ñộ lặp lại 3 lần.
Để 10 phút trong tối ở nhiệt ñộ phòng ñể phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau ñó tiến hành ño OD ở bước sóng 530 nm.
Từ kết quả trên, chúng tôi xác ñịnh ñược phương trình ñường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm. Dựa vào phương trình ñường chuẩn ñể xác ñịnh nồng ñộ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấỵ
Bảng nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,2 0,25 0,5 1 Dung dich ñệm (ml) 2 1,9375 1,875 1,84 1,75 1,5 1 Nồng ñộ IAA (mg/l) 0 5 10 16 20 40 80 Thuốc thử Salkowski (ml) 4 4 4 4 4 4 4
Thực hiện nuôi cấy các chủng Azospirillum phân lập ñược trên môi trường chiết khoai tây (BMS). Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, ñể nguộị Tiến hành cấy các chủng Azospirillum vào các bình tam giác chứa môi trường ñã khử trùng. Nuôi ở nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 72h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong ñể ño lượng IAA ñược vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần.