3. Ý nghĩa của ñề tài
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu mẫu
Rễ cây ngô trong giai ñoạn trổ cờ thuộc các giống khác nhau ñược thu thập một cách ngẫu nhiên, mỗi ruộng lấy năm cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở giữa ruộng) tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk Nông. Toàn bộ bộ rễ ñược ñựng trong túi nilon ñã khử trùng. Các mẫu sau khi lấy ñược ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫụ Mẫu rễ cây ngô sau khi thu ñược ñem tới phòng thí nghiệm, rửa thật sạch ñất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, ñể ráo tự nhiên, ñể riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong túi nilon ñã khử trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (50C) nếu chưa phân lập ngay [5], [17].
2.3.2 Phương pháp phân lập
Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm. Các mẫu rễ ñược ñể riêng trong các bình tam giác tiến hành khử trùng bề mặt. Rễ ñược khử trùng bằng dung dịch chloromine 1% trong 30 phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 700 5 phút, H2O2 3 phút rồi rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (6 lần). Sau ñó lấy khoảng 2g mẫu
cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, ñể yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào eppendorf, ñể yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và lấy phần nước trong ñể tiến hành phân lập. Lấy 0,5ml dịch nghiền rễ cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán ñặc (không ñạm). Ủ ở nhiệt ñộ 320C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Quan sát những ống nghiệm có vòng ñậm (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum. Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán ñặc sang môi trường ñặc tiến hành làm thuần giống [21].
Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc ñược lựa chọn lên các ñĩa petri chứa môi trường NFb ñặc ñể thu khuẩn lạc ñơn. Quá trình làm thuần ñược tiến hành 2 - 3 lần. Chọn khuẩn lạc ñơn ñã ñược làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng ñể giữ giống [5], [21].
* Môi trường Nfb không ñạm: [25], [34]. - Acid Malic: 5g - K2HPO4: 0,5g - MgSO4 .7H2O: 0,2g - NaCl: 0,1g - CaCl2: 0,02g - KOH: 4g
- 1 ml dung dịch stock vitamin (10 mg biotin và 20mg pyridoxine trong 100 ml nước cất).
- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na2MoO4 .2H2O, 235mg MnSO4.H2O, 280 mg H3BO3, 8 mg CuSO4.5H2O, 24 mg ZnSO4.7H2O hòa tan trong 200 ml nước cất).
- Agar: 1,75 g/ lít
- 2ml Bromthymol blue 0,5% - Thêm nước cất vừa ñủ 1 lít. - pH ñiều chỉnh ñến 6,8.
* Môi trường ñặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)
2.3.3 Phương pháp mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng Azospirillum chủng Azospirillum
Mô tả các ñặc ñiểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác ñịnh ñặc ñiểm sinh học và ñịnh danh theo khoá phân loại của Bergey 1994.
2.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum
Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum dựa trên nồng ñộ IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng ñộ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng ñộ IAA ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm [27].
* Phương pháp xác ñịnh phương trình ñường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng ñộ IAẠ
- Chuẩn bị dung dịch ñệm phosphat ( 200ml) A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;
B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa ñủ 200ml, ñiều chỉnh pH 7. - Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất ñủ 1 lít, ñể nguội sau 12 giờ ñược dung dịch H2SO4 ñậm ñặc 10,8M.
Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M ñã pha ở trên ñể ñược thuốc thử Salkowskị
- Chuẩn bị ñường chuẩn IAA
Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch ñệm phosphat ñược nồng ñộ là 160mg/l. Sau ñó tiến hành pha loãng ra các nồng ñộ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l.
Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng ñộ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng ñộ lặp lại 3 lần.
Để 10 phút trong tối ở nhiệt ñộ phòng ñể phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau ñó tiến hành ño OD ở bước sóng 530 nm.
Từ kết quả trên, chúng tôi xác ñịnh ñược phương trình ñường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm. Dựa vào phương trình ñường chuẩn ñể xác ñịnh nồng ñộ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấỵ
Bảng nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,2 0,25 0,5 1 Dung dich ñệm (ml) 2 1,9375 1,875 1,84 1,75 1,5 1 Nồng ñộ IAA (mg/l) 0 5 10 16 20 40 80 Thuốc thử Salkowski (ml) 4 4 4 4 4 4 4
Thực hiện nuôi cấy các chủng Azospirillum phân lập ñược trên môi trường chiết khoai tây (BMS). Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, ñể nguộị Tiến hành cấy các chủng Azospirillum vào các bình tam giác chứa môi trường ñã khử trùng. Nuôi ở nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 72h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong ñể ño lượng IAA ñược vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần.
2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô ñạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô
Đánh giá hoạt tính cố ñịnh ñạm của các chủng Azospirillum dựa trên N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô. N tổng số có trong lá
và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn so với lô ñối chứng, chứng tỏ hoạt tính cố ñịnh ñạm của chủng vi khuẩn càng mạnh.
* Phương pháp thí nghiệm: Hạt ngô lai C919 ñược khử trùng bằng H2O2 3% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất. Sau ñó, cho hạt vào ñĩa petri có bông ñã ñược khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy mầm. Rửa sạch hạt bằng nước cất. Vi khuẩn Azospirillum ñược nuôi trong ống nghiệm sau 72h lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút. Sau ñó ñem gieo 1 hạt/bầu ñất. Loại ñất ñóng bầu là ñất ñỏ Bazan chỉ lấy lớp ñất mặt, mỗi bầu ñóng khoảng 5 kg ñất. Mỗi chủng Azospirillum có 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 15 bầu ñất, thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần.
Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn
Azospirillum
Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm vi khuẩn Azospirillum.
Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài lá, ñường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khô.
Các chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng ñạm tổng số, hàm lượng diệp lục trong lá.
* Phương pháp xác ñịnh hàm lượng ñạm tổng số: Theo phương pháp Kjeldanl [2],[14].
* Phương pháp xác ñịnh hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục (chlorophyll) và carotenoid ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu [36].
- Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, ñể trong tốị - Sau 3 ngày lấy toàn bộ dịch chiết ñịnh mức ñến 100ml. Sau ñó lấy dịch chiết ño ở các bước sóng 663nm, 645nm và 440,5nm.
Hàm lượng chlorophyll a (Ca), chlorophyll b (Cb) và carotenoid (Ccar) ñược tính theo công thức:
Ca = 0,0127 x OD663 - 0,00269 x OD645
Cb (mg x g-1) = 0,0299 x OD645 - 0,00468 x OD663
2.3.6 Phương pháp ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR kỹ thuật PCR
Nuôi cấy vi khuẩn ở pha log (sau 36h), ly trích DNA vi khuẩn và tiến hành nhân DNA bằng máy PCR rồi chạy ñiện di sản phẩm. So sánh ñộ lớn DNA vi khuẩn với thang chuẩn và với mẫu ñối chứng dương Azospirillum lipoferum
AL10. Nếu ñộ dài của DNA vi khuẩn cần nhận diện là 400bp, giống mẫu ñối chứng dương thì ñó là vi khuẩn Azospirillum lipoferum. Phản ứng khuếch ñại DNA ñược thực hiện trong thể tích 25 µl.
Một phản ứng bao gồm: 1,0µL DNA vi khuẩn; 2,5µL 10X PCR buffer; 1,0µL mồi xuôi; 1,0µL mồi ngược; 1,0µL dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0,5µL Taq polymerase; 18µL nước cất vô trùng.
Chu kỳ phản ứng PCR gồm các bước thứ tự như sau: Bước 1: Biến tính các mẫu ADN ở 950C trong 5 phút Bước 2: Thực hiện tiếp ở 950C trong 1 phút
Bước 3: Hạ nhiệt ñộ ñến 550C trong 1 phút Bước 4: Nâng nhiệt ñộ lên 720C trong 1 phút Bước 2 ñến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ.
Bước 5: Giữ ở 720C trong 10 phút Bảo quản sản phẩm PCR ở 40C.
Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Các sản phẩm sau khi ñược khuếch ñại bằng phản ứng PCR, tiếp tục ñem ñiện di trên gel agarose 1,2% có bổ sung thêm ethidium bromide (EtBr).
2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn chủng Azospirillum ñược tuyển chọn
2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum sinh khối của các chủng Azospirillum
Các chủng Azospirillum sẽ ñược nuôi trên 3 loại môi trường Nfb, Fallik,
môi trường nước chiết khoai tây (BMS), ở nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 72 h tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bàọ Mật ñộ tế bào ñược xác ñịnh tương quan OD660 = 1,0 tương ñương với mật ñộ 109 tế bào/ml [26]. Chọn môi trường thuận lợi nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn
Azospirillum ñể tiến hành những thí nghiệm tiếp theọ
* Môi trường Nfb [25], [34]. - Acid Malic: 5g - K2HPO4: 0,5g - MgSO4 .7H2O: 0,2g - NaCl: 0,1g - CaCl2: 0,02g - KOH: 4g
- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập. - Thêm nước cất cho ñủ 1000ml
- Điều chỉnh pH: 6,8
* Môi trường của Fallik [26]. - KH2PO4: 4g - K2HPO4: 6 g - Na-Succinate: 5g - NH4Cl: 1g - MgSO4 .7H2O: 0,2g - Cao nấm men: 0,2g - NaOH: 3,5g - Nước cất vừa ñủ 1 lít - Điều chỉnh pH: 6,8
* Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [12], [34]. - Nước chiết khoai tây: 500ml ( 200g/l )
- KOH: 2,0g - Đường Sacarose: 2,5 g
- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập. - Thêm nước cất vừa ñủ 1 lít.
- pH ñiều chỉnh ñến 6,8.
2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum khối của các chủng Azospirillum
Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc 150 vòng/phút. Sau 24h, 48 h, 72h, 96h tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6].
2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum các chủng Azospirillum
Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường thuận lợi nhất (môi trường ở dạng lỏng) chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc xoay vòng ở các tốc ñộ 0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút. Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6].
2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ñến sinh khối của các chủng Azospirillum
Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường (môi trường ở dạng lỏng), ở các pH 5,8; 6,3; 6,8; 7,3 và 7,8. Nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6].
2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum
Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum cố ñịnh ñạm trên môi trường, pH thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên ở các nhiệt ñộ 270C, 320C,
37 C, 42 C. Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6].
2.3.8 Phương pháp ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn
Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng
Hạt ngô lai C919 ñược khử trùng bằng H2O2 3% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất. Sau ñó, cho hạt vào ñĩa petri có bông ñã ñược khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy mầm. Rửa sạch hạt bằng nước cất. Các chủng vi khuẩn Azospirillum ñã ñược tuyển chon ñược nuôi trong ống nghiệm sau 72 giờ lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút. Với ñối chứng thì ngâm bằng nước cất. Sau ñó ñem gieo, mỗi hốc gieo 2 hạt.
* Bố trí thí nghiệm
Bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên ñầy ñủ thí nghiệm có 11 nghiệm thức, 3 lần lặp lạị
- Nghiệm thức 1: không bón phân ñạm, không nhiễm vi khuẩn
Azospirillum.
- Nghiệm thức 2: không bón phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum
chủng K17.
- Nghiệm thức 3: không bón phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum
chủng K25.
- Nghiệm thức 4: không bón phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum
chủng D06.
- Nghiệm thức 5: bón 50% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K17.
- Nghiệm thức 6: bón 50% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K25.
- Nghiệm thức 7: bón 50% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng D06.
- Nghiệm thức 8: bón 75% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K17.
- Nghiệm thức 9: bón 75% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K25.
- Nghiệm thức 10: bón 75% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum
chủng D06.
- Nghiệm thức 11: bón 100% phân ñạm, không nhiễm vi khuẩn
Azospirillum.
Diện tích mỗi ô thí nghiệm: 2m2 (Chiều dài: 2m; Chiều rộng: 1m) Tổng diện tích thí nghiệm: (11 ô x 2m2/ô) x 3 lần lặp lại = 66m2.
Sơ ñồ bố trí thí nghiệm
Lặp lại Nghiệm thức
I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
II 4 8 6 5 11 10 1 9 2 3 7
III 9 10 7 1 3 2 4 6 11 8 5
* Điều kiện thí nghiệm
+ Khoảng cách gieo
Gieo hàng kép: hàng kép cách nhau 100cm hàng ñơn cách nhau 30cm, cây cách cây 25cm.
+ Lượng phân bón cho 1 ha
Phân chuồng (hữu cơ): 8 tấn/hạ
Phân vô cơ: 300kg Urea + 350kg Lân Văn Điển + 150kg KaliClorua (Theo qui trình của khuyến nông tỉnh Đak Lak).
+ Phương pháp bón
Bón lót: 100% phân chuồng + 100% phân lân. Bón thúc:
- Lần 1: khi cây ngô có 3 – 4 lá ( sau gieo 15 – 18 ngày). Bón cách gốc 10cm. + Với nghiệm thức 5, 6, 7 thì bón lượng ñạm 15%.
+ Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng ñạm là 22,5%. + Với nghiệm thức 11 thì bón lượng ñạm 30%.
- Lần 2: khi cây ngô có 7 – 9 lá ( sau gieo 30 – 35 ngày). Bón cách gốc 10 – 15cm.
+ Với nghiệm thức 5, 6, 7 thì bón lượng ñạm 20%, kali là 50%. + Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng ñạm 30%, kali là 50%. + Với nghiệm thức 11 thì bón lượng ñạm 40%, kali là 50%.
- Lần 3: khi cây ngô xoáy nõn ( sau gieo 40 – 45 ngày). Bón cách gốc 15cm. + Với nghiệm thức 5, 6, 7 thì bón lượng ñạm là 15%, kali là 50%. + Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng ñạm là 22,5%, kali là 50%. + Với nghiệm thức 11 thì bón lượng ñạm 30%, kali là 50%.
* Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Cây theo dõi ñược xác ñịnh sau khi ngô mọc ñược 2 tuần. Cây theo dõi lấy ngẫu nhiên trong ô thí nghiệm, mỗi nghiệm thức ño 6 câỵ Đánh dấu cây theo dõi ñể tiếp tục ño các lần saụ Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Chiều cao cây (cm), số lá trên cây, chiều dài lá (cm), 14 ngày ño 1 lần. Đường kính gốc (mm) ño vào tuần thứ 6 và thứ 8 sau khi ngô mọc, hàm lượng diệp lục trong lá. Các chỉ