Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng thể để phát hiện protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng lai. Việc phân tách protein bằng dòng điện được tiến hành dưới điều kiện biến tính nên các trở ngại như sự hòa tan hay kết tụ, đồng kết tụ của các protein đích với các protein ngoại lai được loại trừ [Sambrook, 2002].
Western blot cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein
có mặt trong các mẫu khác nhau.
Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương pháp lai thấm protein. Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:
Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.
Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.
Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm. - Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.
Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các band ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-kháng thể sơ cấp
Kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.
Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra
do enzyme.
Hình 2.25 Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot