40 H 5 6 Đặc tính của cấu tạo của carotene:
4.3.2.1Vật liệu và phương pháp
Thiết kế vector chứa gen kháng sâu cryIA(b) và cryIA(c) với gen chọn lọc là pmi
Để tạo ra các dòng lúa biến đổi gen kháng sâu bằng hệ thống chọn lọc mannose, người ta đã thiết kế hai vectơ
Vecto pUBB-Man : được thiết kế bằng cách dùng vector pCaCar (Hoa và ctv., 2003) nhưng gen crtI và psy trên vecto nạt được lấy ra bằng enzyme giới han Hind III + BamHIvà thay vào đó là ubiquitin promoter-cry1A(b). Để thực hiện mục tiêu này, ubiquitin-cry1A(b) từ vector pUBB (do Dr. Altosaar cung cấp) được tách ra bằng enzyme gưới hạn HindIII+ SpeI và đoạn AND gần 2,2kb có mang ubiquitin promoter được chọn. Vector pUBB cũng được cắt với SpeI+ BamHI để chọn đoạn DNA khoảng 1,9kb có mang gen cry1A(b) . Hai đoạn DNA 2,2kb và 1,9kb được gắn đồng thời vào vị trí tương ứng Hind III và BamHI trên vector pCaCar. Vector pUBB-Man chuyển vào tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại nhập (competent cell) của A.tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema và CS, 1984).
Hình 4.9 Sơ đồ vecto pUBB - Man
Vector pUBC-Man : được thiết kế băng cách dùng vecto pCaCar (Hoa và CS, 2003) nhưng gen crtI và psy trên vecto này được lấy ra bằng enzyme gưới hạn Hind
III+BamHI và thay vào đó là ubiquitin-cry1A(c) được cắt từ vector pUBC (do Dr. Altosaar cung cấp). Các công đoạn cắt, ghép được thực hiện như trên để tạo ra vector pUBC-Man và được chuyển vào A. tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema và CS, 1984).
Hình 4.10 Sơ đồ vecto pUBC - Man
Giống lúa và phương pháp chuyển gen
Phôi non của giống lúa IR64 và phôi già từ hạt gạo KDML105, Một Bụi được tách và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo. Chọn các mô sẹo có khả năng sinh phôi để chủng với vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA 4404. Phương pháp chuyển gen được thực hiện theo Hoa và Bong (2003). Chọn lọc được tiến hành cách nhau mỗi hai tuần trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có chứa 30g/l sucrose và 25g/l mannose (D(+)-mannose 99+%, Heros Organics, Geel, Belgium) ở vòng chọn lọc thứ nhất, 15 g/l sucrose và 25 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ ba. Các cây kháng mannose được kiểm tra lại bằng xét nghiệm chlorophenol red (CR) (Hoa và Bong, 2003) trước khi chuyển trồng ra đất.
DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và CS (1998). 10 micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI và BamHI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen Cry1A(b) đối với dòng lúa chuyển gen bằng vecto pUBB-Man và cắt đoạn với KpnI (một điểm cắt) để xác định số copy. Tương tự DNA của các dòng lúa chuyển gen bằng vector pUB-Man được cắt đoạn với EcoRI và BamHI hoặc XhoI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen cry1A(c) và cắt với KpnI (1 điểm cắt) để xác định số copy. DNA cắt đoạn được chạy điện đi qua 0,8% agarose gel trước khi chuyển bằng mao dẫn và cố định trên màng nylong (Hybond- N+, Amersham). Gen cry1A(c) và cry1A(b) được đánh dấu bằng DIG (Boeheringer, Rotkreuz, Switzer1) được dùng làm mẫu dò lai (probe). Lai, rửa, phát hiện và xác định gen được thực hiện theo phương pháp của Wiinn và ctv. (1996).
Kết quả chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa
Kết quả nghiên cứu cho thấy chọn lọc bằng mannose cho hiệu quả chuyển gen tương đối cao. Các cây phát triển trên môi trường mannose được kiểm định có mang gen pmi
qua xét nghiệm PCR và phân tích bằng phương pháp Southern blot.Các dòng lúa kháng sâu được tạo ra bằng ứng dụng hệ thống chọn lọc mannose sinh trưởng phát triển bình thường. Nghiên cứu cũng cho thấy lợi điểm của phương pháp biến đổi gen bằng
Agrobacterium. Gen chuyển được gắn vào bộ gen lúa theo phương thức đơn giản ở một locus, không có sự tái sắp xếp, điều này liên qua đến tính ổn định trong biểu hiện của gen chuyển ở các dòng biến đổi gen.
Kết quả các cây được chuyển nạp gen sống và phát triển trên môi trường chọn lọc có chứa mannose được kiểm định bằng phân tích Southern khẳng định có sự hiện diên của gen cryIA( c) hoặc cryIA(b)
Gen kháng sâu cryIA(c ) hoạt động hữu hiệu ở lúa tạo tính kháng sâu đục thân cao, các dòng biến đổi gen kháng sâu đạt tỉ lệ cao và tính kháng sâu hơn hẳn giống chuẩn.