40 H 5 6 Đặc tính của cấu tạo của carotene:
4.3.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa
Agrobacterium tumefaciens[2]
4.3.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa vào cây lúa
Lúa (Oryza sativar L.) là một loại cây trồng quan trọng. Hơn một nửa dân số trên thế giới sử dụng lúa như nguồn cung cấp lương thực chính. Ở Việt Nam, lúa được trồng rộng rãi và là nguồn lương thực quan trọng nhất. Tuy nhiên, năng suất lúa phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, đặc điểm thổ nhưỡng và sâu bệnh. Hiện nay, sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật di truyền và kỹ thuật phân tử cho phép các nhà tạo giống nâng cao tính chống chịu của cây trồng một cách nhanh chóng.
Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ngày càng được ứng dụng rộng rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng. Tính ưu việt của hệ thống chuyển gen này là hiệu quả tạo cây chuyển gen bền vững cao, có thể chuyển một đoạn AND có kích thước tương đối lơn, không cần đến thiết bị cũng như hệ thống nuôi cấy phức tạp. Ngoài ra, lượng bản sao gen chuyển ít tạo thuận lợi trong việc phân tích cũng như biển hiện gen mới trong cây chuyển gen. Những năm gần đay bắt đầu có những kết quả nghiên cứu về khả năng chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở cây lúa trong đó đã chuyển gen thành công cả ở lúa japonica và lúa indica, lúa indica có khả năng tái sinh và chuyển gen thấp hơn so với lúa japonica.
Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là dùng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens để tạo cây lúa mang các gen kháng sâu bện đặc biệt gen kháng sâu đục thân. Vì đối với loại sâu hại này, biện pháp phòng trừ bằng dùng giống kháng không đem lại kết quả. Hơn 30 năm qua Viện Nghiên cứu Lúa quốc tế đã chọn lọc tính kháng sâu đục thân cho hơn 30.000 giống lúa nhưng chưa tìm ra giống kháng (IRRI, 1995). Do vậy, chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa bằng công nghệ gen là phuong pháp nhiều hứa hẹn, việc tạo ra các giống lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân sẽ giúp giảm lượng thuốc trừ sâu, tiết kiệm chi phí và giảm ô nhiễm môi trường.
Một số tác giả thông báo đã tạo được các dòng lúa japonica và indica chuyển gen Bt kháng được sâu đục thân màu hồng, sâu đục thân sọc, sâu đục thân màu vàng và sâu cuốn lá (Fujimote và CS, 1993; Duan và CS, 1996; Nayak và CS, 1997; Datta và CS, 1998). Wu và CS, 2002 báo cáo giống lúa japonica chuyển gen cryIA(b) tạo được tính kháng sâu đục thân ổn định ở thế hệ R6 và trong điều kiện thí nghiệm ngoài đồng. Tuy nhiên, chưa thấy có báo cáo về việc tạo dòng lúa biến đổi gen Bt trên nền giống có đặc tính nông học tốt. Hơn nữa, trong chuyển gen ở cây trồng, hệ thống chọn lọc cây biến đổi gen thông dụng nhất là sử dụng thuốc kháng sinh hoặc thuốc trừ cỏ. Các tế bào đã biến đổi gen có khả năng phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy có chứa chất kháng sinh (thường dùng nhất là hygromycin) hoặc chất trừ cỏ (thường dùng nhất là PPT). Việc sử dụng các hệ thống chọn lọc này gây nhiều lo ngại về tính an toàn của cây trồng biến đổi gen đối với môi trường và sức khỏe con người. Nhằm khắc phục nhược điểm này, gần đây một phương pháp chon lọc mới đã được ứng dụng, đó là hệ thống chọn lọc bằng mannose.
Hệ thống chọn lọc này dựa trên việc sử dụng gen pmi- được phân lập từ Escherichia coli- làm gen chỉ thị để điều khiển tạo ra enzyme phosphomannose isomerase (Miles và Guest, 1984). Trong môi trường nuôi cấy có thêm mannose, tế bào đối chứng không mang gen pmi, enzyme hexokinase trong các tế bào làm biến đổi mannose thành mannose-6-phosphate là nguồn carbon mà tế bào cây không sử dụng nên không phát triển được. Ngược lại, các tế bào có mang gen pmi, enzyme phosphomannose isomerase được tạo ra làm chuyển hóa mannose-6-phosphate là nguồn carbon mà tế bào cây có thể sử dụng cho sự sinh trưởng phát triển. Vì vậy, chỉ có cây trồng có mang gen pmi mới có khả năng phát triển bình thường trong môi trường nuôi cây có chứa mannose, trong khi các cây không có gen pmi không phát triển được. Hệ thống chọn lọc bằng mannose đã được áp dụng trong tạo cây biến đổi gen ở cây củ cải đường (Joersbo và CS, 1998), bắp, lúa mì (Wright và CS,2001) và lúa indica (Hoa và Bong, 2003).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạo cây biến nạp gen cryIA(b) và cryIA(c) kháng sâu bằng Agrobacterium và xử dụng hai hệ thống chọn lọc bằng mannose và chọn lọc bằng kháng sinh trên các giống lúa có đặc tính nông học và phẩm chất tốt. Mục đích so
sánh hai hệ thống chọn lọc nhằm tìm ra phương pháp tối ưu cho công nghệ chuyển gen ở cây lúa và giải pháp khắc phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay.