Desease)
Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã thực hiện giám định bệnh đốm vòng bằng phƣơng pháp DAS ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) và sau đó tiến hành kiểm tra lại kết quả của thí nghiệm ELISA bằng kĩ thuật RT-PCR trên các mẫu dƣơng tính thu đƣợc.
3.3.1. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ
- Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu - Kéo
- Cân phân tích
- Eppendoff 1,5 ml để chứa mẫu sau khi nghiền - Eppendoff 0,2 ml - Hộp đựng eppendoff - Micropipette P1000 - Micropipette P100 - Đầu tip 1000 μl - Đầu tip 100 μl
- Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng và keo dán đĩa ELISA (adhesive film) - Ống đong
- Khay đổ gel điện di
- Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel)
- Các dụng cụ cung cấp kèm theo kit ly trích RNA (nhƣ eppendoff, cột lọc, tube rửa…)
Máy móc, thiết bị
- Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh) - Máy li tâm (Sigma, Hettich)
- Tủ mát ( nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo)
- Tủ định ôn (cài đặt ở 37oC) (Memmert) - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert) - Máy vortex (IKA Works)
- Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Ependof) - Lò viba (Electrolux)
- Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad) - Máy đọc gel (Biorad)
3.3.2. Hóa chất
3.3.2.1. Dùng trong DAS ELISA
Sử dụng kit PLANTEST ELISA® trên đối tƣợng PRSV do hãng Bio Rad cung cấp. Loại kit sử dụng là Kit 480- DAS ELISA.
Hóa chất
- Dịch trích (Extraction buffer X20), trữ ở 2 - 8oC (*) - Dịch rửa (Washing buffer X20), trữ ở 2 - 8oC (*) - Coating buffer X1 (blue), trữ ở 2 - 8oC
- Antibodies (blue cap), trữ ở -20oC - Conjugate buffer X1 (red), trữ ở 2 - 8oC - Conjugate antibodies (red cap), trữ ở -20oC - Substrate buffer X1, trữ ở 2 - 8oC
- Substrate tablets- pNPP (p- nitrophenyl phosphate), dạng viên (5 mg/1 viên), trữ ở 2 - 8o
C (
3.3.2.2. Dùng trong RT- PCR
Hóa chất dùng trong tách chiết RNA
Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp.
- Lysis solution
- Low stringency wash solution (X5) - High stringency wash solution
- Dnase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng) - Dnase dilution solution
- Elution solution - β- mercaptoethanol, 14,2 M (catalog #161-0710) (*) - Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 % (*) - Ethanol 100 % và 70 % (*) - Tris-base (pH 7,5, 10 mM) (*) - Nitơ lỏng (*) - NaOH 0,1M (*) - EDTA 1mM (*)
- DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (*)
(*): Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit.
Hóa chất sử dụng tạo cDNA
Sử dụng kit iScriptTM
cDNA Synthesis Kit do Bio-Rad cung cấp - iScript Reaction Mix (X5)
- Nuclease-free water
- iScript Reverse Transciptase
Hóa chất sử dụng trong PCR
- Nuclease-free water - iTaq buffer (X10)
- iTaq DNA polymerase (Bio-Rad) - MgCl2 (50 mM)
- dNTP mix (10 mM) (Bio-Rad) - DMSO
Cặp primer 1 (kích thƣớc sản phẩm khuếch đại là 900 bp) (Roberto C.A. Lima, 2002)
Sense 5‟- ATC ATT CCA TGG GCG TGT TCC ATG AAT CAA- 3‟ Antisense 5‟- AGC TAA CCA TGG GCG AGT ATT CAG TTG CGC- 3‟ Cặp primer 2 (kích thƣớc sản phẩm khuếch đại là 429 bp)
P7 5‟- CGG GAC CAG TGG AAC TTT CAC G- 3‟ M30 5‟- CCT CTC AGT GGC ATT TCT CTT TGC- 3‟ Cặp primer 3 (kích thƣớc sản phẩm khuếch đại là 658 bp)
P14 5‟- CCA AGA ATG AAG CTG TGG ATG C- 3‟ M31 5‟- ATC GAA AGC GTA TCT AGC GAG GC- 3‟ Trong đó, P- plus: mồi dƣơng hay mồi xuôi (forward primer). M- minus: mồi âm hay mồi ngƣợc (reverse primer).
Hóa chất sử dụng trong điện di
- Agarose
- TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8) - Blue/Orange Loading dye 6X (Promega)
- Ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích)
- Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 % - Ladder 100 bp (kích thƣớc 1500 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 2 %
3.3.3. Quy trình thực hiện 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA Ly trích mẫu
Mẫu sau khi lấy ra từ tủ -20oC đƣợc cắt thành mảnh nhỏ, cân khoảng 0,5 g cho vào cối nghiền trong 2,5 ml dung dịch đệm ly trích (extraction buffer X1); sao cho tỉ lệ giữa lƣợng mẫu và dịch trích là 1:5. Do virus tồn tại nhiều trong bó mạch libe nên khi chọn mẫu nghiền thƣờng ta nên chọn phần gân lá và nên chọn các lá non. Tiến hành nghiền cho đến khi mẫu mịn ra và hòa tan đều trong dịch trích, sau đó cho tất cả dịch thu đƣợc vào một eppendoff 1,5 ml sạch, có nắp và đem ly tâm ở 7000 vòng/3 phút ở 4oC. Ghi chú thông tin cần thiết lên eppendoff. Mẫu sau khi nghiền có thể bảo quản ở 2 - 8oC trong vòng 48 giờ.
Thực hiện thí nghiệm ELISA
- Bƣớc 1: Phủ kháng thể vào các giếng:
Trƣớc tiên phải pha loãng kháng thể với tỉ lệ kháng thể/ dịch đệm là 1/500. Nhƣ vậy, hóa chất pha cho mỗi dĩa gồm 10 ml buffer và 20 μl kháng thể. Phân phối dịch pha loãng vào các dĩa sao cho 100 μl/giếng. Sau đó dùng băng keo trong (adhesive film) dán dĩa lại và đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Ủ xong, đem rửa dĩa bằng dịch rửa PBS- TWEEN X1 ba lần với máy rửa dĩa ELISA.
Sơ đồ phủ kháng thể 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B (*) C (*) D (*) E (*) F (*) G (*) H
- Bƣớc 2: Phân phối dịch trích mẫu vào các giếng cũng với thể tích 100 μl/giếng. Đồng thời ở giai đoạn này ta cũng phân phối các đối chứng âm và dƣơng vào các giếng đối chứng. Sự phân phối tiến hành theo từng cặp nhƣ sơ đồ.
: Giếng đƣợc phủ bởi nƣớc cất : Giếng đƣợc phủ bởi kháng thể
: Giếng không sử dụng (không đƣợc phủ bởi bất kì chất nào)
Sơ đồ phân phối dịch trích mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B (*) BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C (*) BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D (*) PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E (*) PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F (*) NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G (*) NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H
Sau khi phân phối ta dùng adhesive film đậy dĩa và ủ dĩa qua đêm ở nhiệt độ 2 - 8oC. Ủ xong ta tiến hành rửa dĩa 3 lần với PBS- TWEEN X1.
- Bƣớc 3: Phân phối các conjugate antibodies vào các giếng (100 μl/giếng). Conjugate antibodies cũng cần đƣợc pha loãng trƣớc sử dụng với tỉ lệ conjugate antibodies/ conjugate buffer là 1/500. Nhƣ vậy hóa chất cần pha cho mỗi dĩa gồm 10 ml buffer và 20 μl conjugate. Sau đó ta đậy dĩa và ủ ở 37oC trong 2 giờ và tiến hành rửa 3 lần bằng dung dịch PBS- TWEEN.
: Giếng đƣợc phủ bởi nƣớc cất
: Giếng đƣợc phủ bởi dịch trích mẫu (Sample)
: Giếng đƣợc phủ bởi dịch ly trích mẫu (extraction buffer X1)
: Giếng đƣợc phủ bởi đối chứng dƣơng (positive control)
: Giếng đƣợc phủ bởi đối chứng âm (negative control)
B F (*) P C N C
Sơ đồ phân phối conjugate antibodies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B (*) C (*) D (*) E (*) F (*) G (*) H
- Bƣớc 4: Phân phối substrate (100 μl/giếng). Trƣớc khi phân phối, ta cần hòa tan substrate (ở dạng viên) trong buffer tƣơng ứng sao cho nồng độ cuối là 1 mg/ml. Nhƣ vậy mỗi dĩa, lƣợng hóa chất cần pha là 10 ml buffer cho 2 viên substrate (5 mg/viên). Đậy dĩa lại và đem đi ủ ở 37oC trong 30 phút và sau đó thì để ở nhiệt độ phòng.
Sơ đồ phân phối substrate
s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H : Giếng đƣợc phủ bởi nƣớc cất
: Giếng đƣợc phủ bởi conjugate antibodies
: Giếng không sử dụng (không đƣợc phủ bởi bất kì chất nào)
- Bƣớc 5: Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA (ở bƣớc sóng 405 nm) sau 30 phút ủ với substrate, đọc lại lần 2 sau 1giờ và đọc lần 3 sau 2 giờ. Trong đó, giá trị và biện luận của test ELISA đƣợc tính thông qua các giá trị đo OD của buffer, các đối chứng dƣơng, âm và của mẫu sau khi đã trừ đi giá trị OD của các giếng substrate (các giai đoạn đầu đƣợc phủ bằng nƣớc cất).
OD mẫu = OD đọc đƣợc – OD của giếng substrate
Giá trị OD này của mẫu sẽ đƣợc so sánh với một giá trị gọi là ngƣỡng (với ngƣỡng = hai lần giá trị OD trung bình của đối chứng âm)
Kết quả: POS- đƣợc đánh giá là nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt xa ngƣỡng NEG- đƣợc đánh giá là không nhiễm bệnh khi giá trị OD của mẫu dƣới ngƣỡng.
Ngoài ra, còn có thể đọc kết quả bằng mắt thƣờng thông qua sự tạo màu có thể nhìn thấy đƣợc của substrate bị thủy phân bởi enzyme:
+ Màu vàng tƣơng ứng với kết quả dƣơng tính + Không màu tƣơng ứng với kết quả âm tính.
Tuy nhiên phƣơng pháp này độ tin cậy không cao so với việc đọc kết quả bằng máy.
3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR Ly trích RNA (xem sơ đồ trang 36)
Tạo cDNA
Phản ứng tạo cDNA đƣợc thực hiện trong 20 μl bao gồm: - 5X iScript Reaction Mix 4 μl
- iScript Reverse Transcriptase 1 μl - Nuclease-free water 10 μl
- RNA mẫu 5 μl
: Giếng đƣợc phủ bởi substrate
: Giếng không sử dụng (không đƣợc phủ bởi bất kì chất nào)
Sơ đồ ly trích RNA Mẫu tƣơi 60 mg/eppendoff, có nắp, 2ml Nghiền trong N2 lỏng - Trộn đều bằng pipette - Ly tâm/ 3 phút
Thu dịch nổi cho vào một eppendoff, 2ml, có nắp mới
14 μl PVP 2 % 700 μl Lysis
solution
700 μl EtOH 70 %
Trộn đến khi không còn phân lớp
Ly tâm/ 1 phút Hút 700 μl cho vào RNA binding
column
Thực hiện tƣơng tự cho đến khi hết dung dịch trong tube hòa tan với EtOH 70 %
Thu RNA binding column
Thu RNA binding column Ly tâm/ 30 s 700 μl Low wash stringency 80 μl dung dịch Dnase I - Ủ 15 phút/ to phòng - Ly tâm/ 30 s
Thu RNA binding column 700 μl High wash stringency
Ly tâm/ 30 s Thu RNA binding column 700 μl Low wash stringency
- Ly tâm/ 30 s
- Ly tâm/ 1 phút
Thu RNA binding column 80 μl Elution solution
- Ủ/ 1 phút
- Ly tâm 2 phút
Thu dịch lỏng (trữ ở 4oC)
Phản ứng khuếch đại cDNA
- Phản ứng PCR chuẩn đƣợc thực hiện trong 25 μl bao gồm: (Roberto C.A. Lima, 2002)
Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng
iTaq buffer MgCl2 dNTP mix iTaq DNA polymerase
Nuclease-free water Primer Sense Antisense cDNA 10 X 50 mM 10 mM 5 u/μl 2,2 μg/μl 2,4 μg/μl 1 X 3,5 mM 0,4 mM 2 u 100 ng/μl 100 ng/μl 2,50 μl 1,75 μl 1,00 μl 0,40 μl 14,85 μl 0,50 μl 0,50 μl 3,00 μl
- Phản ứng PCR cải tiến (có bổ sung chất tăng cƣờng (enhancer) là DMSO)
Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng
iTaq buffer MgCl2 dNTP mix iTaq DNA polymerase
Nuclease-free water DMSO Primer Sense Antisense cDNA 10 X 50 mM 10 mM 5 u/μl 100 % 2,2 μg/μl 2,4 μg/μl 1 X 3,5 mM 0,4 mM 2 u 2 % 100 ng/μl 100 ng/μl 2,50 μl 1,75 μl 1,00 μl 0,40 μl 14,85 μl 0,50 μl 0,50 μl 0,50 μl 3,00 μl
Chu kì nhiệt (Roberto C.A. Lima, 2002)
Chu kì nhiệt chuẩn của
phản ứng PCR Chu kì nhiệt 1 Chu kì nhiệt 2
- 94oC/7 phút - 94 oC/3 phút 50 oC/1 phút 72 oC /3 phút 1 chu kì - 94 oC /1 phút 52 oC /1 phút 72 oC /3 phút 30 chu kì - 72 oC /10 phút - 4 oC /1 h - 94oC/7 phút - 94 oC/3 phút 58 oC/1 phút 72 oC /3 phút 1 chu kì - 94 oC /1 phút 60 oC /1 phút 72 oC /3 phút 30 chu kì - 72 oC /10 phút - 4 oC /1 h - 94oC/7 phút - 94 oC/3 phút 60 oC/1 phút 72 oC /3 phút 1 chu kì - 94 oC /1 phút 65 oC /1 phút 72 oC /3 phút 30 chu kì - 72 oC /10 phút - 4 oC /1 h
Điện di trên gel agarose
- Sử dụng gel ở nồng độ 1,5 % (đối với ladder có kích thƣớc 1000 bp). - Sử dụng gel ở nồng độ 2 % (đối với ladder kích thƣớc 1500 bp).
Bơm mẫu vào giếng với tỉ lệ mẫu/ loading dye là 4:2. Trƣớc khi bơm vào giếng, mẫu phải đƣợc trộn đều với loading dye bằng pipette.
Tiến hành điện di ở 50 V, 250 A trong 60 phút.
Điện di xong, lấy gel ra và cho vào bồn Ethium bromide ngâm trong 15 - 20 phút. Sau đó lấy ra rửa sạch Ethium bromide và đem quan sát kết quả điện di bằng máy đọc gel (do Ethium bromide là một hóa chất rất độc hại, nên khi tiếp xúc với nó cần phải luôn mang găng tay).
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN