3. ðễI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.1. Gõy miễn dịch cho chuột
Theo phương phỏp của Milstein và Kohler năm (1975), cú cải tiến theo Eryl Liddell và A.Cryer, (2000) [28].
Trộn khỏng nguyờn P3 - BSA với một lượng cựng thể tớch của tỏ dược Freund,s adjuvant cú tỏc dụng làm tăng hoạt tớnh khỏng nguyờn. Lượng P3- BSA ủược pha chế cú nồng ủộ sao cho thể tớch tiờm cho mỗi chuột mỗi lần bằng 0,2ml.
Ban ủầu, chuột cỏi BALB/c (6 tuần tuổi) ủược tiờm dưới da ở 4 vị trớ dọc theo lưng.
Chuột ủược tiờm nhắc lại vào dưới da bụng với cựng một lượng P3 - BSA lỳc 2 và 4 tuần sau lần tiờm thứ nhất. Cỏc mẫu mỏu ủược lấy từ ủuụi
38
hoặc hốc mắt ở cỏc khoảng thời gian sau mỗi lần tiờm bồi và tỏch huyết thanh ủể theo dừi hỡnh thành khỏng thể bằng ELISA. Chuột ủược tiờm bồi lần cuối cựng với lượng P3 - BSA trong 0,1ml dung dịch sinh lớ khụng trộn với tỏ dược vào ven ủuụi lỳc 3 ủến 4 ngày trước khi lấy tế bào lỏch ủể dung hợp với tế bào myeloma.
3.3.2. Phương phỏp lấy ủại thực bào
Theo phương phỏp của Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000)[31] Giết chuột, khử trựng chuột trong cồn 70o. Tiờm vào xoang bụng 3ml dung dịch PBS. Dựng bơm tiờm và hỳt dung dịch trong xoang bụng ra, ủưa vào ống li tõm. Lặp lại như trờn 3 lần. Dịch hỳt ra từ xoang bụng cú chứa tế bào ủược kiểm tra dưới kớnh hiển vi. Cho dịch tế bào li tõm ở tốc ủộ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Sau li tõm, hỳt bỏ dịch nổi, hũa lại cặn (tế bào) với 10 ml dung dịch PBS. Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cựng cặn tế bào ủược hũa trong 1ml DMEM FBS 10%. ðếm tế bào, pha ủiều chỉnh sao cho dịch tế bào cú mật ủộ 103 tế bào/ml, trong mụi trường DMEM 10% FBS.
3.3.3. Phương phỏp lấy tế bào lympho B của chuột
Theo phương phỏp của Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000)[31] Giết chuột ủó ủược gõy miễn dịch bằng P3 - BSA, khử trựng chuột bằng cồn 70o. Tỏch lấy thựy lỏch và cỏc hạch vào ủĩa petri cú sẵn 10ml dung dịch PBS. Dựng kộo cắt lỏch và cỏc hạch thành từng mảnh nhỏ, gạt nhẹ ủể cỏc tế bào rời ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống li tõm, dựng pipet paster hỳt lờn, ủẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. ðể dung dịch lắng cặn, hỳt lấy dung dịch tế bào sang một ống li tõm khỏc. Li tõm dung dịch tế bào ở tốc ủộ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, Sau ủú loại bỏ hết dịch nổi và hũa cặn tế bào trong 10ml PBS. Lặp lại thao tỏc này 3 lần, lần cuối cựng hũa cặn tế bào với DMEM cú bổ sung 10% FBS sao cho cú mật ủộ 108 tế bào/ml.
39
3.3.4. Nuụi cấy tế bào myeloma dũng Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18
a- ðỏnh thức và nhõn nuụi tế bào myeloma:
Chuyển ống tế bào từ trong nitơ lỏng vào cốc nước 36oC – 37oC. Khi dung dịch bờn trong ống cất ủó tan ủỏ hoàn toàn, lau khử trựng phớa ngoài bằng cồn 70o. Chuyển dung dịch bờn trong ống sang một ống li tõm, tiến hành li tõm với tốc ủộ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Gạn bỏ lớp dịch nổi chứa DMSO. Hũa tan cặn tế bào bằng mụi trường nuụi cấy rồi chuyển tế bào sang chai nuụi cấy thớch hợp. Sau ủú ủể chai nuụi vào tủ ấm 37oC, 5%CO2.
Sau khi tế bào ủược ủỏnh thức thành cụng, phỏt triển bỡnh thường, khụng bị nhiễm khuẩn, nhõn nuụi ủể ủạt ủược lượng tế bào cần thiết 104- 105 tế bào/ml mụi trường nuụi cấy. Trung bỡnh sau 2- 3 ngày mụi trường phải ủược thay mới. Vỡ lỳc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phỏt triển tế bào ủó thay ủổi. Nếu mụi trường khụng ủược thay ủỳng lỳc, tế bào sẽ chết. ðể thay mụi trường trước hết cần ly tõm, hỳt bỏ mụi trường cũ, tiếp ủú ủưa từ 5- 7 ml mụi trường nuụi cấy phự hợp. ðể tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuụi.
b, Bảo quản tế bào trong lạnh sõu
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trờn 95%, khụng bị nhiễm tạp khuẩn. ðổ bỏ mụi trường cũ thay vào ủú là mụi trường mới, dựng pipet hỳt lờn ủẩy xuống cho tế bào rời ủều trong mụi trường. Hỳt dung dịch tế bào sang ống li tõm, li tõm ở 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Gạn bỏ dịch nổi, hũa cặn tế bào với mụi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào trong ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi ủạt ủược – 25oC thỡ ủưa nhanh ống cất vào lạnh – 70oC, sau 20 giờ chuyển vào bỡnh N2 lỏng.
3.3.5. Dung hợp tế bào và tỏch dũng
Dung hợp: Hỗn dịch tế bào lympho B (nồng ủộ 106/ml) ủược ủưa vào cựng với tế bào myeloma . Sau ủú thờm vào 1ml PEG khuấy kĩ trong 1 phỳt, 5 phỳt sau thờm vào 3,5 ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT và ủ qua ủờm ở 37oC 5%CO2, li tõm hỗn dịch tế bào, hũa cặn vào 30ml mụi trường
40
huyết thanh cú bổ sung HAT và phõn phối vào cỏc giếng của ủĩa nhựa Falcon 0,1ml. Sau dung hợp từ 5 – 7 ngày thờm vào mỗi giếng 0,1 ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi van dựng phản ứng ELISA ủể phỏt hiện khỏng thể mong muốn.
Chọn tế bào từ cỏc giếng cú hiệu giỏ khỏng thể cao ủể tỏch dũng.
Tỏch dũng: Sau khi kiểm tra khả năng tạo khỏng thể bằng ELISA, ta biết ủược giếng nào cú khỏng thể, tuy nhiờn ủõy là khỏng thể ủa dũng do nhiều dũng tế bào lai tạo thành. ðể cú khỏng thể ủơn dũng ta phải tiến hành tỏch dũng như sau:
- Chọn 1 giếng mà dịch nổi cú hiệu giỏ khỏng thể cao nhất trộn ủều cỏc tế bào trong giếng ủó chọn thành hỗn dịch tế bào thuần nhất. Hỳt hỗn dịch tế bào sang ống li tõm cú chứa mụi trường phỏt triển ủể pha loóng tế bào sao cho nồng ủộ chỉ ủạt 1 tế bào/ 100àl.
- Chuyển tế bào ủó pha loóng sang nuụi trong cỏc giếng ủó cú tế bào nuụi, sau ủú chuyển vào nuụi trong tủ ấm CO2 ở ủiều kiện tiờu chuẩn.
- Thay mụi trường cho tế bào 2 ngày một lần.
- Sau khi tế bào phỏt triển tốt (gần kớn ủỏy), kiểm tra lại hiệu giỏ khỏng
thể. Chọn ra giếng cú hiệu giỏ khỏng thể cao nhất nhõn lờn với lượng lớn ủể
bảo quản hoặc tiờm vào ổ bụng chuột, thu dịch bỏng.
3.3.6. Sản xuất dịch bỏng chuột chứa khỏng thểủơn dũng
Quy trỡnh sản xuất dịch bỏng chuột chứa khỏng thể ủơn dũng với nồng ủộ cao tiến hành theo cỏc bước sau ủõy:
1. Tiờm cho chuột BALb/c 4 tuần tuổi 0,5 ml pristane vào ổ bụng. 2. Sau 14 ngày, tiờm vào ổ bụng mỗi chuột từ 1-3x106 tế bào lai hoà trong PBS 0,01M chứa ion Ca++ và Mg++.
3. Theo dừi chuột khi nào bụng phồng to chứa nhiều dịch bỏng thỡ dựng bơm tiờm vụ trựng hỳt thu hoạch dịch. Sau khi thu hoạch, chuột lại ủược nuụi tiếp ủể tạo dịch bỏng mới. Cú thể thu hoạch dịch bỏng 4 -5 lần từ mỗi chuột.
41
4. Li tõm dịch ở tốc ủộ 2000 v/phỳt 10 phỳt, 4oC. Thu nước nổi ủể làm cỏc bước tiếp theo.
3.3.7. Phương phỏp tinh sạch khỏng thể
Quy trỡnh tinh sạch khỏng thể ủược tiến hành bằng phương phỏp kết tủa với sulphat amon theo Liddell và Cryer, (1978) [28]. ðược tiến hành theo cỏc bước sau:
1. Nhỏ từ từ sulphat amon bóo hoà vào dịch nuụi tế bào hay dịch bỏng ủể cú nồng ủộ 45% sunphat amon bóo hoà. Khuấy ở nhiệt ủộ 40C, 30 phỳt. Sau ủú ly tõm 1000 vũng/phỳt, 15 phỳt ở 40C.
2. Rửa phần kết tủa bằng dung dịch sunphat amon bóo hũa cú nồng ủộ 45% trong PBS và ly tõm 2000 vũng/phỳt, 15 phỳt ở 40C.
3. Hoà phần kết tủa vào một thể tớch PBS bằng thể tớch dịch nuụi tế bào ban ủầu và ly tõm 5000 vũng/phỳt, 15 phỳt ở 40C ủể loại bỏ chất thụ khụng hoà tan.
4. Chuyển nước nổi sang ống nghiệm mới, kết tủa lại IgG bằng cỏch bổ sung sunphat amon bóo hoà vào nước nổi ủể ủạt tới nồng ủộ 40% sunphat amon bóo hoà. Ly tõm 1000 vũng/phỳt, 15 phỳt, 40C.
5. Hoà tan chất kết tủa vào 1 lượng nhỏ PBS (0,5 ml) thẩm tớch trong 5lit PBS ở 40C qua ủờm.
6. Xỏc ủịnh nồng ủộ protein và bảo quản ở -700C
Lượng dung dịch sunphat amon bóo hoà bổ sung vào mỗi ml dịch nuụi tế bào ủể cú nồng ủộ sunphat amon mong muốn ủược tớnh theo cụng thức sau:
1 ì (Sf – Si) V =
1 – Sf Trong ủú:
V: Lượng dung dịch sunphat amon bóo hoà tớnh bằng ml Sf: Nồng ủộ sunphat amon cần ủạt
42 Vớ dụ: Cần nồng ủộ sunphat amon bằng 45% Theo cụng thức: 1 (0,45 – 0) 1-0,45 = 0,82 ml 3.3.8. Phương phỏp ELISA
Nguyờn lớ: Dựng khỏng thể (khỏng thể 1) liờn kết với khỏng nguyờn sau ủú liờn kết với (khỏng thể 2) gắn enzyme, tiếp ủú cho cơ chất vào, cơ chất sẽ bị enzyme tỏc ủộng tạo nờn màu (do enzyme phõn hủy cơ chất).
Phản ứng ELISA giỏn tiếp gồm cỏc bước sau:
1- Phủ bản bằng 100 àl khỏng nguyờn P3- BSA (KN) trong coating buffer ở 4o C qua ủờm (nồng ủộ 125 ng KN/giếng). Khỏng nguyờn P3 - BSA sẽ gắn cố ủịnh trờn bề mặt của bản. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer ủể loại bỏ những KN khụng gắn vào bề mặt bản. Che chắn bản bằng 300 àl washing buffer + 1% skim milk trong 1h ở 37oC. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer.
2- Bổ sung khỏng thể 1 (dịch nổi của mụi trường nuụi cấy) ủó pha loóng 5000 lần bằng washing buffer + 1% sữa. Ủ ở 37oC trong 1 giờ. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer loại bỏ những khỏng thể khụng liờn kết ủặc hiệu với KN.
3- ðưa vào mỗi giếng 100àl khỏng thể 2 gắn enzyme peroxidase ủược pha loóng 10 000 lần trong ủệm washing buffer + 1% sữa. ðem ủ bản ở 37oC trong 1 giờ. Rửa bản 10 lần bằng Washing buffer
4- ðưa vào mỗi giếng 100 àl dung dịch cơ chất TMB. Ủ bản ở 37oC trong 10 phỳt.
5- Dừng phản ứng bằng cỏch bổ sung 50 àl H2SO4
6- ðo giỏ trị OD (mật ủộ quang học) bằng ELISA reader.
43
