4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ðỏnh giỏ kết quả gõy ủỏp ứng miễn dịch bằng phương phỏp ELISA
4.1. đỏnh giỏ kết quả gõy ủỏp ứng miễn dịch bằng phương phỏp ELISA
ELISA
Tỏm chuột cỏi BALB/c ủược chia làm 4 lụ thớ nghiệm và gõy miễn dịch như sau:
Sau thời gian gõy miễn dịch cho chuột theo quy trỡnh gõy miễn dịch ủó trỡnh bày ở phần phương phỏp, chỳng tụi tiến hành lấy mẫu mỏu của từng chuột thớ nghiệm, tỏch huyết thanh của chuột trong mỗi lụ thớ nghiệm, sử dụng phương phỏp ELISA giỏn tiếp ủể so sỏnh khả năng ủỏp ứng miễn dịch của cỏc cỏ thể tức là khả năng sinh khỏng thể khỏng progesteron. Phản ứng ELISA ủược sử dụng ủể phỏt hiện sự cú mặt của khỏng thể trong huyết thanh.
Ở cỏ thể chuột ủó ủược gõy miễn dịch sẽ sinh khỏng thể khỏng ủặc hiệu progesteron, khỏng thể này ủược kiểm tra bằng phản ứng ELISA. để tiến hành phản ứng ELISA giỏn tiếp cần phải cú: khỏng nguyờn ủó biết, khỏng thể cần kiểm tra cú thể kết hợp ủặc hiệu với khỏng nguyờn, khỏng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sỏt màu thay ủổi khi ủưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tỏc dụng của enzyme.
44
đọc kết quả bằng mỏy ủo mật ủộ quang học (OD) tương ứng với bước súng của màu thể hiện.
kết quả phản ứng ELISA ủược trỡnh bày ở bảng 1:
Mỗi mẫu huyết thanh của chuột ủược thử nghiện trong 11 giếng (n=11) trờn khay ELISA cú 96 giếng.
Bảng 1. Kết quảủỏp ứng miễn dịch của chuột thớ nghiệm Lụ thớ nghiệm I II III IV Chuột số 1 2 3 4 5 6 7 8 Lượng KN(àg/lần) 50 50 100 100 200 200 300 300 Giỏ trị OD trung bỡnh (n=11) {{ 2,412 ổ0,02 1 1,998 ổ0,01 8 3,015 ổ0.02 4 3,004 ổ0.02 7 3,548 ổ0.02 5 3,942 ổ0.03 5 3,540 ổ0.02 9 3,538 ổ0.03 6 đối chứng (-) 0,30 (BSA 0.1% ủược sử dụng làm ủối chứng õm)
Phản ứng ELISA hay phản ứng miễn dịch ủỏnh dấu enzyme là phản ứng dựng enzyme gắn vào khỏng thể (gắn Enzym) kết hợp với khỏng khỏng thể 1 khỏng nguyờn, dựng cơ chất thớch hợp ủể phỏt hiện.
Nếu lượng enzyme ủược giữ lại càng nhiều thỡ màu thể hiện càng rừ, giỏ trị OD càng lớn (cũng cú nghĩa lượng khỏng thể cần xỏc ủịnh càng nhiều).
Nếu trong mẫu khụng cú khỏng thể cần xỏc ủịnh thỡ khụng cú enzyme nờn phản ứng màu khụng xảy ra.
Trong cỏc thớ nghiệm ủược thực hiện, chỳng tụi sử dụng cơ chất là TMB, enzyme gắn khỏng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thỡ phản ứng sinh màu xanh da trời, màu vàng xuất hiện khi dừng phản ứng bằng
45
H2S04. Bước súng hấp phụ của màu tương ứng là 450 nm khi ủọc kết quả bằng mỏy ủo mật ủộ quang học (OD).
Từ kết quả bảng 1 cho thấy:
+ Với liều 50 àg P3- Al/ con/ lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh ủược kiểm tra của chuột số 1 là 2,142 ổ0,021, của chuột số 2 là 1,998 ổ0,018
+ Với liều 100 àg/ con/ lần cho giỏ trị OD ở mẫu cần kiểm tra của chuột số 3 là 3,015 ổ0,024, chuột số 4 là 3,004 ổ0,027
+ Với liều 200 àg/ con/ lần thỡ giỏ trị OD ở mẫu huyết thanh kiểm tra của chuột số 5 là 3,548 ổ0,025, mẫu huyết thanh của chuột số 6 cho giỏ trị
OD là 3,942 ổ0,035
+ Với liều 300 àg/ con/ lần thỡ giỏ trị OD ở mẫu huyết thanh kiểm tra của chuột số 7 là 3,540 ổ0,029, mẫu huyết thanh của chuột số 8 cho giỏ trị OD là 3,538 ổ0,038
Giỏ trị OD phản ỏnh hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Giỏ trị OD càng nhỏ chứng tỏ hàm lượng khỏng thể càng ớt và ngược lại giỏ trị OD càng cao thỡ hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh càng nhiều. Với giỏ trị OD ≤ 0,30 ủược coi là khụng cú khỏng thể.
* Kết quả thu ủược cho thấy:
+ Khi gõy miễn dịch với liều lượng khỏng nguyờn khỏc nhau sẽ cho cỏc ủỏp ứng miễn dịch khỏc nhau với cựng loại khỏng nguyờn P3-Al.
+ Với liều 200 àg P3-Al/ con/ lần cho kết quả ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất (giỏ trị OD của cỏc mẫu kiểm tra ở lụ 3 cao hơn giỏ trị OD của cỏc mẫu kiểm tra ở lụ 2, lụ 1 và lụ 4)
+ Cựng lượng khỏng nguyờn 200 àg/ con/ lần nhưng chuột số 5 cho giỏ trị OD là 3,548 ổ0,025, chuột số 6 cho giỏ trị OD là 3,942 ổ0,035
Cú thể ủưa ra nhận xột là:
đỏp ứng miễn dịch của cơ thể phụ thuộc vào lượng khỏng nguyờn ủưa vào cơ thể chuột. đồng thời ủỏp ứng miễn dịch cũng cũn phụ thuộc vào từng cỏ thể.
46
Dựa trờn cơ sở kết quả ủỏp ứng miễn dịch, chuột số 5 và chuột số 6 (lụ thớ nghiệm 3) cú ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất khi dựng liều 200 àg/ con/ lần gõy miễn dịch. Vỡ vậy, chỳng tụi chọn liều 200 àg/con/ lần là thớch hợp nhất ủể gõy miễn dịch cho chuột thớ nghiệm nhằm thu ủược những cỏ thể chuột cú ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất.
Như vậy, với liều 200 àg/ con/ lần, chỳng tụi tiếp tục tiến hành gõy miễn dịch cho 5 chuột cỏi BALB/c khỏc theo quy trỡnh gõy miễn dịch ủó trỡnh bày ở phần phương phỏp. Sau ủú chỳng tụi tiến hành lấy mẫu mỏu, tỏch huyết thanh ủể kiểm tra ủỏp ứng miễn dịch của từng chuột bằng phản ứng ELISA. Chuột nào cú ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất sẽ ủược chọn ủể thu lấy tế bào lympho B của lỏch cho quỏ trỡnh lai tế bào sau này.
đõy là bước lựa chọn cỏ thể chuột cú khả năng ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất, từ ủú thu lấy tế bào lympho B của lỏch phục vụ cho bước lai tế bào sau này. Bước này rất quan trọng vỡ nếu chỳng ta chọn chớnh xỏc cỏ thể cú ủỏp ứng miễn dịch tốt, sinh nhiều khỏng thể thỡ sẽ nõng cao chất lượng tế bào lympho B, từ ủú tăng hiệu quả lai tế bào.
Với 5 mẫu huyết thanh thu ủược từ 5 chuột BALB/c chỳng tụi tiến hành pha loóng 1000 lần trước khi thực hiện thớ nghiệm kiểm tra bằng phương phỏp ELISA .
Kết quả phản ứng ELISA (giỏ trị OD) ủo ở bước súng 450 nm bằng mỏy Microplate Reader (BioRad) nhằm kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng ủặc hiệu progesteron ủược trỡnh bày ở bảng 2.
47
Bảng 2. Sự cú mặt của khỏng thể khỏng ủặc hiệu Progesteron trong cỏc mẫu huyết thanh thu từ cỏc chuột gõy ủỏp ứng miễn dịch với P3 Ờ Al (n=5) STT Mẫu kiểm tra Giỏ trị OD (n=5) độ pha loóng
1 Chuột số 1 3,155 ổ0,054 1000 2 Chuột số 2 4,203 ổ0,03 1000 3 Chuột số 3 3,917 ổ0,04 1000 4 Chuột số 4 3,756 ổ0,045 1000 5 Chuột số 5 3,543 ổ0,037 1000 6 đối chứng õm (BSA 0,1%) 0,32 1000
BSA: Bovine Serum Albumin
Giỏ trị OD phản ỏnh nồng ủộ khỏng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật ủộ quang học càng nhỏ chứng tỏ lượng khỏng thể ủược giữ lại càng ớt và ủiều này cũng chứng tỏ rằng hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh ớt. Ngược lại, mật ủộ quang học càng lớn chứng tỏ lượng khỏng thể ủược giữ lại càng nhiều và kộo theo hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh cũng nhiều.
Từ kết quả bảng 2 cho thấy:
- Với giỏ trị OD ≤ 0,32 ủược coi là khụng cú khỏng thể
- Với liều tiờm 200 àg P3 Ờ Al/con/lần nhưng mỗi chuột lại cho một kết quả khỏc nhau cho thấy khả năng ủỏp ứng miễn dịch ở cỏc cỏ thể chuột khỏc nhau là khỏc nhau.
Kết quả kiểm tra cỏc mẫu huyết thanh của 5 chuột ủều cho giỏ trị OD cao, chứng tỏ cả 5 chuột thớ nghiệm ủều cú khả năng ủỏp ứng miễn dịch tốt (OD > 3,0). Như vậy cú thể nhận ủịnh rằng liều 200 àg P3 Ờ Al/con/lần là phự hợp.
- Mẫu huyết thanh kiểm tra của chuột số 1 cú giỏ trị OD thấp nhất (3,155) và mẫu huyết thanh của chuột số 2 cú giỏ trị OD cao nhất (4,203).
Kết quả này cho thấy hàm lượng khỏng thể khỏng P3 Ờ Al trong huyết thanh của chuột số 1 là thấp nhất, hàm lượng khỏng thể khỏng Progesteron trong huyết thanh của chuột số 2 là cao nhất.
48
Như vậy, ủỏp ứng miễn dịch khụng chỉ phụ thuộc vào liều lượng khỏng nguyờn ủưa vào mà cũn phụ thuộc vào cỏ thể ủộng vật. Mỗi cỏ thể ủộng vật cú ủỏp ứng miễn dịch khỏc nhau, do ủú nồng ủộ khỏng thể trong huyết thanh khỏc nhau mặc dự tiếp nhận cựng một lượng khỏng nguyờn như nhau:
Kết quả ủỏp ứng miễn dịch phụ thuộc vào hai yếu tố chớnh: + Liều lượng khỏng nguyờn ủưa vào cơ thể.
+ Mỗi cỏ thể khỏc nhau sẽ cho ủỏp ứng miễn dịch khỏc nhau với cựng loại và liều lượng khỏng nguyờn.
Dựa vào kết quả ủỏp ứng miễn dịch, ta thấy chuột số 2 và 3 cú ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất nờn sẽ ủược lựa chọn ủể lấy tế bào Lympho B và dung hợp với tế bào Myeloma nhằm thu ủược tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng cú chất lượng cao.
