4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất khỏng thể ủơn dũng khỏng P3 Al
Dung hợp là quỏ trỡnh quan trọng trong sản xuất khỏng thể ủơn dũng. để quỏ trỡnh dung hợp tạo tế bào lai diễn ra thuận lợi và ủạt kết quả cao cần cú 2 loại tế bào chủ yếu là Myeloma và Lympho B. Ngoài ra cần bổ sung cỏc yếu tố thỳc ủẩy cho quỏ trỡnh dung hợp như: tế bào ủại thực bào, FBS, polyethylenglycol (PEG).
Ớ Tế bào ủại thực bào (macrophaghe cũn gọi feeder cell)
Cỏc tế bào ủại thực bào cú mặt chủ yếu ở cỏc xoang cơ thể, ủặc biệt là xoang bụng vỡ thể ta cú thể dễ dàng lấy tế bào ủại thực bào từ ổ bụng.
Cỏc tế bào ủại thực bào là tế bào của hệ miễn dịch ủó biệt hoỏ hoàn toàn. Do ủú, chỳng khụng cú khả năng sinh sản liờn tục khi nuụi cấy in vitro.
đó cú nhiều tỏc giả nghiờn cứu và xỏc ủịnh: Tế bào ủại thực bào ủược chuẩn bị 3 ngày trước dung hợp sẽ ủạt hiệu quả cao nhất.
Theo kết quả của chỳng tụi thỡ một con chuột cú thể cung cấp một lượng ủại thực bào ủủ cho 200 Ờ 500 giếng nuụi tương ứng với mật ủộ 105 Ờ 107 tế bào/ml.
49
Ớ Tế bào Myeloma
Tế bào Myeloma (Sp2/0, P3X) là tế bào ung thư tuỷ của chuột dũng BALB/c. Ở ủiều kiện nuụi cấy in vitro thớch hợp, tế bào sinh sản và phỏt triển rất nhanh, cú thể ủạt nồng ủộ tế bào gấp 5 lần chỉ trong khoảng thời gian 30 giờ. Vỡ vậy, chỳng ủũi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn lấy từ mụi trường. để cú ủược tế bào Myeloma khoẻ mạnh và sẵn sàng cho việc dung hợp tế bào, chỳng tụi thấy mụi trường cú bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) là phự hợp. Và mụi trường nuụi cấy cần ủược tiến hành thay thường xuyờn 3 ngày một lần.
A B
Hỡnh 7. (A) Tế bào Sp2/0 ởủộ phúng ủại 10ì20; (B) Tế bàoP3X ởủộ phúng ủại 10ì20
Ớ Tế bào Lympho B mẫn cảm khỏng nguyờn P3 - Al
Là những tế bào Lympho B ủó mẫn cảm, thu từ lỏch chuột số 2 ủược gõy miễn dịch bằng P3 - Al với liều 200 àg P3 - Al/con/lần.
Dung hợp tế bào lai:
Quy trỡnh dung hợp tế bào ủược thực hiện theo quy trỡnh như ủó trỡnh bày ở phần phương phỏp. Tế bào sau dung hợp ủược nuụi trờn 3 khay nhựa 96 well Ờ corning (tổng số là 288 giếng).
Sau 5 Ờ 7 ngày dung hợp, chỳng tụi tiến hành sàng lọc tế bào bằng mụi trường chọn lọc HAT ủể thu ủược tế bào lai (Hybridoma). Do tế bào Myeloma khụng cú enzym HPRT (Hypoxanthin - phospho Ờ ribosyl Ờ transferase) dẫn ủến khụng tổng hợp ủược ADN.
50
Vỡ vậy, khi mụi trường cú HAT, bazơ cung cấp cho quỏ trỡnh tổng hợp ADN ở dạng liờn kết nờn ủũi hỏi phải cú enzym ủể thuỷ phõn liờn kết này. Như thế, tế bào Myeloma sẽ chết sau vài ngày. Tế bào Lympho B phỏt triển bỡnh thường trong mụi trường HAT vỡ nú cú enzym HPRT nhưng tế bào Lympho B cũng chết sau 1 - 2 ngày do khụng tiếp tục sinh sản. Do ủú, chỉ cỏc tế bào lai tồn tại ủược trong mụi trường HAT và HT nhờ cú ưu thế lai.
Sau 5 ngày nuụi cấy chỳng tụi kiểm tra toàn bộ số giếng dưới kớnh hiển vi soi ngược và ủỏnh dấu những giếng cú tế bào lai. Chỳng tụi ủó thu ủược tỷ lệ giếng cú tế bào lai trờn tổng số giếng thực hiện dung hợp giữa tế bào lỏch chuột với hai dũng tế bào Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18 như ủược trỡnh bày ở bảng 3.
Từ kết quả bảng 3 cho thấy:
Hiệu quả lai trờn 2 dũng tế bào myeloma với tế bào lympho B của 2 chuột 2 và 3 ủều ủạt trờn 70% cho thấy qui trỡnh lai tế bào của chỳng tụi là rất phự hợp.
Bảng 3. Tỷ lệ giếng cú tế bào lai trờn tổng số giếng thực hiện dung hợp. Chuột Chuột số 2 Chuột số 3 Tổng số Chuột Chuột số 2 Chuột số 3 Tổng số
Dũng tế bào P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0
Số giếng thực hiện
dung hợp tế bào 144 144 144 144 288 288
Số giếng cú tế bào
lai 102 117 109 124 211 241
Hiệu quả lai 70,83 % 81,25 % 75,69 % 86,11 % 73,2 % 83,6 %
Như vậy tỷ lệ giếng cú tế bào lai dũng Sp2/0- Ag14 của chuột số 2 và số 3 cao hơn hẳn so với với dũng P3X- Ag18.
51
Tế bào lỏch của chuột số 2 và 3 lai với dũng Sp2/0-Ag14 cho tổng số kết quả lai bằng 83,6% . Trong khi ủú dũng P3X-Ag18 cú kết quả lai bằng 73,2%.
A B
Hình 8. (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng