Số clone/giếng
đĩa TN 0 clone/giếng 1 clone/giếng ≥2 clone/giếng
đĩa 1 30/96 50/96 16/96
đĩa 2 15/96 70/96 11/96
đĩa 3 42/96 36/96 18/96
Tổng số 87/288 156/288 45/288
Hiệu quả 30,21% 54,17% 15,63%
Như vậy trong tổng số 288 giếng ở 3 khay thỡ cú 156 giếng cú mật ủộ 1clone/giếng, ủạt hiệu quả tỏch dũng là 54,17%. Tế bào ủược nuụi trong khoảng thời gian 2 tuần, sau ủú thu dịch nổi và sử dụng phương phỏp ELISA ủể kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng ủặc hiệu Pogesteron trong dịch nổi của cỏc giếng cú 1clone tế bào/ giếng sau khi tỏch dũng.
Sau khi kiểm tra 156 giếng cú 1clone/ giếng bằng phương phỏp ELISA thỡ chỳng tụi chỉ thu ủược 35 giếng cú dịch nổi cú phản ứng dương tớnh với khỏng nguyờn progesteron.
Như vậy chỉ cú 35 clone tế bào sản xuất khỏng thể khỏng lại progesteron. đõy chớnh là khỏng thể ủơn dũng (01 clone tế bào) mà chỳng ta mong muốn.
Kết quả tỏch dũng với 35 giếng cú phản ứng dương tớnh cho thấy sự cú mặt của khỏng thể khỏng progesteron ủược thể hiện ở bảng 7
56 Bảng 7: Giỏ trị OD của dịch nổi của cỏc giếng dương tớnh khỏng progesteron cú 1 dũng tế bào STT Tờn giếng đĩa TN Giỏ trị OD (n=3) 1 A8 1 0,927 ổ 0,019 2 A11 1 0,878 ổ 0,018 3 C2 1 0,619 ổ 0,012 4 C4 1 0,509 ổ 0,010 5 D7 1 0,796 ổ 0,016 6 E3 1 0,76 ổ 0,015 7 E7 1 1,983 ổ 0,040 8 E9 1 0,732 ổ 0,015 9 F1 1 0,468 ổ 0,009 10 F9 1 0,680 ổ 0,031 11 G2 1 0,462 ổ 0,015 12 G9 1 1,542 ổ 0,013 13 H3 1 0,764 ổ 0,011 14 H6 1 0,650 ổ 0,010 15 B9 2 0,531 ổ 0,015 16 C6 2 0,502 ổ 0,017 17 E6 2 0,864 ổ 0,010 18 F2 2 0,504 ổ 0,015 19 F11 2 0,742 ổ 0,017 20 F12 2 0,872 ổ 0,018 21 G4 2 0,889 ổ 0,033 22 G12 2 1,673 ổ 0,029 23 H4 2 1,437 ổ 0,040 24 H8 2 1,979 ổ 0,015 25 H12 2 0,745 ổ 0,014 26 A3 3 0,678 ổ 0,012 27 B5 3 0,579 ổ 0,010 28 C7 3 0,491 ổ 0,013 29 C8 3 0,647 ổ 0,012 30 F9 3 0,608 ổ 0,016 31 G5 3 0,648 ổ 0,010 32 G10 3 0,789 ổ 0,012 33 G11 3 0,502 ổ 0,016 34 H2 3 0,613 ổ 0,038 35 H6 3 0,787 ổ 0,019 đC + 1,921 đC - 0,355
57 Kết quả cho thấy:
Trong 35 giếng dương tớnh, cỏc giếng khỏc nhau cú giỏ trị OD khỏc nhau. điều này chỳng tỏ mỗi dũng tế bào khỏc nhau thỡ khả năng sinh khỏng thể cũng khỏc nhau. Vỡ vậy cú thể thấy cỏc giếng cú tế bào lai sinh khỏng thể cú chất lượng cao phụ thuộc nhiều vào dũng tế bào lympho B cú ủỏp ứng miễn dịch tốt với khỏng nguyờn hay khụng và dũng tế bào Myeloma (qua thực nghiệm ủó chứng minh dũng tế bào Sp2/0-Ag14 tốt hơn dũng P3X-Ag18).
Từ kết quả của bảng 7: chỳng tụi chọn ra 5 dũng tế bào sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng ủặc hiệu Progesteron tốt nhất tương ứng với 5 giếng cú giỏ trị OD cao nhất là:
+ Giếng E7 ủĩa 1 với giỏ trị OD = 1,983 ủặt tờn là MCAP1 + Giếng G9 ủĩa 1 với giỏ trị OD = 1,542 ủặt tờn là MCAP2 + Giếng G12 ủĩa 2 với giỏ trị OD = 1,673 ủặt tờn là MCAP3 + Giếng H4 ủĩa 2 với giỏ trị OD = 1,437 ủặt tờn là MCAP4 + Giếng H8 ủĩa 2 với giỏ trị OD = 1,979 ủặt tờn là MCAP5
Với 5 dũng tế bào ủó chọn lọc, chỳng tụi tiến hành nuụi in vitro ủể cú số lượng lớn tế bào. để quỏ trỡnh nhõn nuụi ủạt kết quả tốt, từ 5 dũng tế bào chọn ủược chỳng tụi ủưa vào 5 chai nuụi cấy sao cho ủạt nồng ủộ 1ì 105 tế bào/ml. Cỏc chai nuụi cấy ủược bổ sung mụi trường thớch hợp cho cỏc tế bào lai phỏt triển tốt và nuụi trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Mụi trường nuụi cấy chỳng tụi sử dụng gồm cỏc thành phần: DMEM và bổ sung FBS 10%.
4.3.1 Chọn lọc dũng tế bào sinh khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu và ủộ nhạy cao
* Tớnh ủặc hiệu
để khẳng ủịnh tớnh ủặc hiệu của khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron của 5 dũng tế bào thu ủược ở trờn, chỳng tụi tiến hành kiểm tra bằng phương phỏp ELISA. Kiểm tra tớnh ủặc hiệu của khỏng thể ủơn dũng sinh ra là kiểm tra khả năng kết hợp của khỏng thể ủơn dũng với khỏng nguyờn và cỏc chất
58
khỏc cú cấu trỳc phõn tử tương tự như Progesteron và cú trong huyết thanh là hormon steroid như progesteron, estradiol, testosteron, corticosteron và pregnenolon. Ngoài progesteron ra trong mỏu ủộng vật cũn cỏc hormon steroid trờn cú cấu tạo hoỏ học gần giống với progesteron. Chỳng tụi dựng khỏng thể ủơn dũng mới thu ủược lần lượt thử nghiệm với ủại diện cỏc nhúm khỏng nguyờn cú cấu tạo hoỏ học gần giống với Progesteron núi trờn và thu ủược kết quả qua bảng 8 như sau:
Bảng 8. Tớnh ủặc hiệu của khỏng thểủơn dũng do 5 dũng tế bào tạo ra
S TT
Khỏng nguyờn
Dũng tế bào Progesteron Estradiol Testosteron Corticosteron Pregnenolon
1. MCAP1 + - - - + 2. MCAP2 + - + + - 3. MCAP3
+ - - - -
4. MCAP4 + - - - + 5. MCAP5 + - + - - Ghi chỳ: (+): dương tớnh; (-) õm tớnh Kết quả ở bảng 8. cho thấy:- Cỏc dũng MCAP1 và MCAP4 ủều cho kết quả dương tớnh với 2 loại khỏng nguyờn là progesteron và pregnenolon. Dũng MCAP2 MCAP5 cho kết quả dương tớnh với progesteron nhưng cũng dương tớnh với cả testosteron và corticosteron.
Như vậy, khỏng thể do 4 dũng tế bào này sinh ra cú tớnh ủặc hiệu khụng
cao khụng phõn biệt ủược giữa progesteron với cỏc dạng hormon gần giống
với chỳng.
- Chỉ cú dũng MCAP3 cho kết quả õm tớnh với Estradiol, Testosteron, Corticosteron, Pregnenolon và chỉ dương tớnh với progesteron chứng tỏ rằng khỏng thể do dũng tế bào này sinh ra cú tớnh ủặc hiệu cao. Chỳng ủó phõn biệt
59
ủược cỏc loại hormon gần giống với progesteron và chỉ khỏng ủặc hiệu progesteron.
Chỳng ta thấy rằng khỏng thể ủơn dũng là khỏng thể chỉ cú khả năng kết hợp ủặc hiệu với một loại khỏng nguyờn duy nhất mà khụng kết hợp với cỏc loại khỏng nguyờn khỏc cho dự chỳng cú cấu tạo hoỏ học gần giống với khỏng nguyờn ủú.
* Khả năng sinh khỏng thể của cỏc dũng tế bào
Một dũng tế bào cú chất lượng cao ngoài khả năng sinh khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu cao cũn cần phải cú sức sống tốt, khả năng sinh khỏng thể nhiều từ ủú mới ủảm bảo tạo ủược một lượng lớn khỏng thể trờn quy mụ cụng nghiệp, ủủ ủể phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế.
- Dựa trờn kết quả kiểm tra tớnh ủặc hiệu và khả năng phỏt triển của 5 dũng tế bào, chỳng tụi chỉ chọn dũng MCAP3 cú tớnh ủặc hiệu cao, tiếp tục nhõn nuụi thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Nitơ lỏng và gõy bỏng cho chuột nhằm thu lượng khỏng thể cao.
4.4. Gõy bỏng cho chuột
Khỏng thể ủơn dũng cú thể thu nhận từ dịch nổi của chai nuụi tế bào hybridoma. Tuy nhiờn theo Karsten và Rudloph (1985) thỡ ta cú thể thu nhận ủược khỏng thể cao hơn từ 100 ủến 1000 lần nếu tiờm cỏc tế bào lai vào xoang bụng của chuột ủó ủược tiờm pristane trước ủú 2 tuần. Sau khoảng từ 7 ủến 12 ngày bụng chuột cú bỏng to thỡ thu dịch bỏng. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi ủó gõy bỏng thành cụng ủược 2 con chuột (số 5 và số 10)/ 10 chuột cỏi BALB/c bằng dũng MCAP3 và thu ủược khoảng 5ml/con/lần ủược 3-5 lần/con.
4.5. Kiểm tra hiệu giỏ khỏng thể
Dịch bỏng thu ủược lưu giữ ở 4ỨC qua ủờm trước khi ủược chỳng tụi tiến hành tinh sạch bằng phương phỏp kết tủa với Saturated Amonium Sulphate (SAS) hoặc bằng Propur Kit của hóng Nunc.
60
đối với dịch nổi nuụi cấy của dũng MCAP3 chỳng tụi sử dụng mụi trường nuụi cấy ủặc biệt khụng cú huyết thanh (Hybridoma Medium) của hóng GIBCO BRL. Chỳng tụi nhận thấy tế bào phỏt triển tốt trong loại mụi trường này ủạt 1x106 tế bào/ 3 ngày. Sau 3 ngày nuụi cấy, dịch nổi ủược thu giữ và cất ở 4oC qua ủờm trước khi tinh sạch bằng phương phỏp SAS hoặc bằng Propur Kit.
Trước khi tiến hành tinh sạch, dịch nổi và dịch bỏng ủược chỳng tụi tiến hành kiểm tra hiệu giỏ khỏng thể. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 9.
Bảng 9. So sỏnh hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi và dịch bỏng. STT độ pha loóng STT độ pha loóng Mẫu TNo 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000 lần 1 Dịch nổi (nguyờn) ++++ +++ +++ ++ ++ + - 2 Dịch bỏng (pha loóng 20 lần) ++++ +++ +++ ++ ++ + -
(++++): màu rất ủậm (++): màu ủậm vừa (-):khụng màu (+++): màu ủậm (+): màu nhạt
A B
Hình 10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng ở các độ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần.
10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần
61
Quan sỏt bảng 9. ta thấy hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi và dịch bỏng thể hiện là như nhau nhưng hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi là nguyờn bản trong khi ủú hiệu giỏ khỏng thể của dịch bỏng ủó pha loóng 20 lần.
Như vậy cú nghĩa là hiệu giỏ khỏng thể ủơn dũng trong dịch bỏng cao gấp khoảng 20 lần so với dịch nổi. đồng thời kết quả thớ nghiệm cho thấy hiệu giỏ khỏng thể thu ủược là cao (500 lần của dịch nổi) và 10.000 lần của dịch bỏng, từ ủú cú thể phục vụ cho mục ủớch thương mại.
Sau khi thu ủược dịch nổi và dịch bỏng của dũng tế bào MCAP3 chỳng tụi tiến hành tinh sạch bằng SAS và Propur Kit. Kết quả tinh sạch ủược trỡnh bày ở bảng 10.
Nhỡn vào bảng 10, ta thấy tổng lượng khỏng thể ủơn dũng khỏng Progesteron tinh sạch ủược bằng SAS là 1,808mg. Trong khi ủú tinh sạch bằng Propur Kit là 2,55mg.
Bảng 10. Kết quả tinh sạch khỏng thểủơn dũng bằng (SAS) và Propur Kit.
Sử dụng SAS Sử dụng Propur Kit
Dũng tế
bào
Dịch
nổi
(100ml)
Dịch bỏng
pha loóng
10 lần
(50ml)
Tổng
lượng
MoAb thu
ủược
Dịch
nổi
(100ml)
Dịch bỏng
pha loóng
10 lần
(50ml)
Tổng
lượng
MoAb thu
ủược
MCAP
3
0,43
àg/ml x
100 ml
(43àg)
35,3 àg/ml x
50 ml
(1,765mg)
1,808 mg 0,45
àg/mlx
100 ml
(45àg)
50,1àg/ml x
50 ml
(2,505mg)
2,55 mg
Tổng lượng KTđD khỏng Progesteron thu ủược là 4,358 mg
Như vậy cú sự khỏc nhau rừ rệt khi tinh sạch bằng SAS và sử dụng Propur Kit. Sử dụng Propur Kit ủể tinh sạch khỏng thể sẽ thu ủược lượng khỏng thể cao hơn so với phương phỏp SAS.
Lượng khỏng thể ủơn dũng thu ủược ở trờn ủược chỳng tụi lưu giữ bằng ủệm PBS ở nồng ủộ 1mg/ml và cất ở -80oC.
62
Với mục ủớch là sử dụng khỏng thể ủơn dũng trong thực tiễn sản xuất vớ dụ phỏt hiện ủộng vật cú chửa nờn chỳng tụi ủó sử dụng khỏng thể ủơn dũng thu ủược ở trờn ủể kiểm tra huyết thanh của 6 thỏ thớ nghiệm bằng phương phỏp ELISA. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 11.
Kết quả từ bảng 11. cho thấy khỏng thể ủơn dũng mà chỳng tụi thu ủược ủó phản ứng ủặc hiệu và phỏt hiện ủược Progesteron trong huyết thanh của thỏ thớ nghiệm. Khụng những thế do ở thỏ khụng chửa thỡ trong mỏu vẫn tồn tại progesteron nờn khỏng thể ủơn dũng ở dịch nổi và dịch bỏng cũng như khỏng thể ủơn dũng tinh sạch vẫn phỏt hiện ủược do vậy cú phản ứng dương tớnh. Tuy nhiờn ở thỏ khụng chửa thỡ hàm lượng prgesteron thấp hơn nhiều so với thỏ chửa. Do vậy cỏc dịch nổi, dịch bỏng và khỏng thể ủơn dũng tinh sạch bị pha loóng ủó khụng thể hiện phản ứng dương tớnh với thỏ khụng chửa trong khi vẫn thể hiện dương tớnh với cỏc thỏ chửa.
Bảng 11. Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thớ nghiệm
Thỏ chửa Thỏ khụng chửa động vật TN Dịch khỏng thể C1 C 2 C 3 K 1 K 2 K 3 Khụng pha + + + + + + Dịch nổi Pha loóng 10 lần + + + - - - Pha loóng 10 lần + + + + + + Dịch bỏng Pha loóng 50 lần + + + - - - Pha loóng 100 lần (10 àg/ml)
+ + + + + +
Khỏng thể tinh sạch Pha loóng 500 lần (2 àg/ml)+ + + - - -
điều này cho phộp chỳng tụi kết luận rằng khỏng thể ủơn dũng chỳng tụi thu ủược cú phản ứng ủặc hiệu với progesteron và phõn biệt ủược ủộng vật cú chửa và ủộng vật khụng cú chửa ở tỷ lệ pha loóng phự hợp (500X).
63
5. KẾT LUẬN 5.1 KẾT LUẬN
5.1 KẾT LUẬN
Qua quỏ trỡnh làm việc nghiờm tỳc với cỏc nội dung: gõy ủỏp ứng miễn dịch cho chuột, dung hợp tạo tế bào lai, tỏch dũng tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng ủặc hiệu progesteron, chọn lọc dũng tế bào lai theo mong muốn, tinh sạch khỏng thể, dựng khỏng thể ủơn dũng ủó sản xuất ủể kiểm chứng phỏt hiện ủộng vật cú chửa, chỳng tụi rỳt ra một số kết luận sau:
1. Tiến hành gõy miễn dịch với liều lượng khỏng nguyờn P3 - Al bằng 200àg/con/lần tiờm sẽ cho ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất. đỏp ứng miễn dịch của cơ thể khụng những phụ thuộc vào liều lượng khỏng nguyờn gõy miễn dịch mà cũn phụ thuộc vào cỏ thể ủộng vật.
2. Sau dung hợp và tỏch dũng chỳng tụi, ủó chọn ra ủược 05 dũng tế bào cú khả năng sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron như mong muốn. 3. Trong quỏ trỡnh nhõn nuụi và dung hợp tế bào, chỳng tụi nhận thấy tế bào lai giữa tế bào lympho B với tế bào Sp2/0-Ag14 cú sức sống mạnh hơn, tế bào sinh sản nhanh hơn so với dũng tế bào P3X-Ag18 trong ủiều kiện bỡnh thường với cả hai loại mụi trường nuụi cấy là DMEM và RPMI 1640.
4. Trong 5 dũng tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng ủược chọn lọc dũng tế bào MCAP3 cú khả năng sinh sản tốt, khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu và hiệu giỏ khỏng thể cao ủể nhõn nuụi, gõy bỏng trờn chuột và bảo quản trong nitơ lỏng. 5. Cú sự khỏc nhau rừ rệt khi tinh sạch bằng hai phương phỏp SAS và sử dụng Propur Kit. Sử dụng Propur Kit tinh sạch khỏng thể sẽ cho hiệu suất cao hơn so với SAS.
6. Khỏng thể ủơn dũng chỳng tụi thu ủược cú phản ứng ủặc hiệu với progesteron và sử dụng trong ELISA ủó phõn biệt ủược ủộng vật cú chửa và ủộng vật khụng cú chửa.
64
5.2 đỀ NGHỊ
Quy trỡnh sản xuất khỏng thể ủơn dũng gồm nhiều giai ủoàn khỏc nhau, trong quỏ trỡnh ủú việc sử dụng phương phỏp ELISA ủể sàng lọc, kiểm tra và ủỏnh giỏ khỏng thể ủơn dũng là cần thiết và thực sự ủó ủem lại hiệu quả. Tuy nhiờn ủể hoàn thành cỏc bước của quy trỡnh và cú ủược khỏng thể ủơn dũng chất lượng cao hơn ủỏp ứng ủược việc tạo kớt ủịnh lượng progesteron thỡ cần phải nghiờn cứu sõu hơn nữa. đặc biệt, việc phõn tớch cỏc ủặc tớnh quan trọng của khỏng thể ủơn dũng thu ủược như xỏc ủịnh isotope ủặc hiệu, xỏc ủịnh ỏi lực khỏng nguyờn - khỏng thể vv.
đề tài của chỳng tụi mới chỉ cú ủược những kết quả bước ủầu, tạo ủược những dũng tế bào lai sản xuất khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron năng suất cao, chất lượng tốt. Chỳng tụi mong muốn ủược tiếp tục nghiờn cứu theo hướng này ủể tạo ra ủược sản phẩm cuối cựng là bộ kớt chuẩn ủể ủịnh lượng progesteron trong dịch sinh học (mỏu, nước tiểu...) phục vụ cho nghành chăn nuụi nước nhà.
65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1.
Vũ Triệu An, Lờ đức Cơ, Văn đỡnh Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh,
đỗ Trung Phấn, Phạm Hoàng Phiệt (1981), Những kỹ thuật cơ
bản dựng trong miễn dịch học, NXB y dược học.Tr5-284
2. Vũ Triệu An, Jean Claude Homber (1998), Miễn dịch học, NXB Y học Hà Nội. Tr 7- 277.
3. Nguyễn Tấn Anh (1998), Sinh lớ sinh sản gia sỳc, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
4. Lờ Trần Bỡnh, Phan Văn Chi, Nụng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lờ
