Acetate Cholesterol Progestero
n Pregnenolo n Progestero n Pregnandio l Glucuronat Pregnandio l Glucuronat Pregnanetri ol
31 c- Vai trũ của Progesteron
Với cỏc kết quả nghiờn cứu hiện nay về progesteron, vai trũ của hormon này thể hiện qua hai hướng:
* Hướng thứ nhất: Tỏc ủộng tới cơ quan sinh dục
+ ðối với buồng trứng: với liều lượng thấp nú kớch thớch sự phỏt triển của nang trứng, cũn với liều lượng cao sẽ gõy ức chế phỏt triển và ức chế rụng trứng.
+ ðối với tử cung: Progesteron cú vai trũ quan trọng trong việc chuẩn bị niờm mạc tử cung ủể trứng làm tổ và kớch thớch sự phỏt triển của nhau thai.Nếu như oestrogen làm tăng sinh tế bào niờm mạc õm ủạo tớch lũy nhiều glycogen, tăng sinh sừng tử cung thỡ progesteron kớch thớch sự phỏt triển hơn nữa của niờm mạc tử cung, làm phỏt triển mao mạch tử cung ủể chuẩn bị ủún thai giỳp cho phụi dễ cố ủịnh và phỏt triển trờn màng nhày tử cung. Progesteron cú tỏc dụng làm giảm tớnh mẫn cảm co búp của nội mạc tử cung thụng qua cơ chế ức chế cỏc men oxy húa như gluconidaza, photphataza, cacboanhydraza, do ủú làm giảm tớnh mẫn cảm của cơ tử cung, ức chế sự co búp của cơ trơn tử cung làm tử cung yờn tĩnh, cú tỏc dụng an thai. Nếu cắt thể vàng trong những ngày ủầu mang thai sẽ gõy xảy thai.
+ Progesteron kớch thớch sự hỡnh thành cỏc tiểu thựy và cỏc tỳi (bao), tuyến của bầu vỳ, chuẩn bị cho tiết sữa.
Ngoài ra, progesteron cũn ủược xem là nhõn tố cú vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh rụng trứng, progesteron cú tỏc dụng làm tăng hoạt tớnh của enzyme phỏ vỡ thành bao noón (Hunter.R, 1972) [27]
* Hướng thứ hai: tỏc ủộng ngược trở lại Hypothalamus và tuyến yờn nhằm kớch thớch hoặc ức chế tiết cỏc hormon của tuyến này: Khi nồng ủộ progesteron trong mỏu giảm sẽ kớch thớch trung khu sinh dục trong Hypothalamus tiết GnRH. Sự tăng tiết GnRH kớch thớch thựy trước tuyến yờn tiết FSH làm cho cỏc nang nguyờn thủy trong buồng trứng phỏt triển và cỏc tế
32
bào tăng tiết oestrogen. Khi nồng ủộ oestrogen trong mỏu tăng cao sẽ kớch thớch thựy trước tuyến yờn tiết LH gõy hiện tượng rụng trứng, hỡnh thành và phỏt triển thể vàng, thể vàng tiết progesteron. Khi progesteron trong mỏu tăng cao sẽ ức chế Hypothalamus, giảm tiết ra Gonadostimulin dẫn ủến thựy trước tuyến yờn bị ức chế phõn tiết FSH, LH và do ủú ức chế noón bao chớn trong buồng trứng. Với vai trũ này của progesteron, progesteron ủược xem là hormon “ chỡa khúa” ủể thiết lập và duy trỡ chu kỡ sinh dục bỡnh thường ở con cỏi.
d- Ứng dụng của Progesteron
+ Progesteron kết hợp với estrogen cú tỏc dụng trỏnh thai do ức chế tiết GnRH, dẫn ủến giảm tiết FSH, LH và do ủú ức chế sự phỏt triển và chớn của trứng, trứng khụng rụng.
+ Sử dụng phương phỏp ELISA, EIA, RIA…ủịnh lượng progesteron trong mỏu, sữa và nước tiểu chẩn ủoỏn cú thai sớm và những rối loạn sinh sản ở gia sỳc cỏi.
Vớ dụ: ðịnh lượng progesteron trong mỏu và sữa ủể chẩn ủoỏn trõu, bũ cú chửa. Khi hàm lượng progesteron ≥ 3 ng/ml huyết thanh thỡ bũ cú chửa, chớnh xỏc tới 90%. Xỏc ủịnh từ ngày 21 – 22 sau thụ thai. Ở sữa, hàm lượng progesteron ≥ 11 ng/ml sữa thỡ bũ cú chửa, nếu nhỏ hơn 8 ng/ml sữa thỡ bũ khụng cú chửa (Nguyễn Xuõn Tịnh và cộng sự, 1996)[14].
Sử dụng kĩ thuật EIA ủể ủịnh lượng progesteron trong huyết thanh kết hợp khỏm buồng trứng qua trực tràng, Phan Văn Kiểm và cộng sự, năm (2002) [09] ủể chẩn ủoỏn một số bệnh ở buồng trứng gõy chậm sinh:
- Hàm lượng progesteron cao (≥1,4 ng/ml huyết thanh) ở cỏc thời ủiểm lấy mẫu là 0 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày thỡ những bũ này ủược xỏc ủịnh là buồng trứng cú thể vàng.
33
- Hàm lượng progesteron nhỏ hơn 0,6 ng/ml thỡ xỏc ủịnh ủược là buồng trứng cú u nang noón.
- Hàm lượng progesteron rất thấp (0,08- 0,19 ng/ml huyết thanh) thỡ bũ cú buồng trứng kộm hoạt ủộng.
+ Dựng kết hợp progesteron và prostaglandin giỳp khắc phục hiện tượng chậm sinh do làm mất sự tồn tại của thể vàng và nang nước (Trần Tiến Dũng và cộng sự, 2002) [05].
+ Gõy ủộng dục ủồng loạt: 20 ngày ủầu, tiờm progesteron ủể kỡm hóm sự tiết kớch dục tố GSH của tuyến yờn. Ngày thứ 21, tiờm huyết thanh ngựa chửa gõy kớch thớch tiết kớch dục tố trờn mức bỡnh thường, kết quả 88,4 % lợn ủộng dục và 87 % thụ thai (Nguyễn Xuõn Tịnh và cộng sự, 1996) [14].
e- ðặc ủiểm của khỏng nguyờn progesteron
Progesteron là hormone, giống nhau và cú ở tất cả cỏc ủộng vật cú vỳ, vỡ thế tự nú khụng thể là khỏng nguyờn, bản thõn nú khi tiờm vào cơ thể con vật khụng cú khả năng kớch thớch sinh ra khỏng thể. Mặt khỏc, trọng lượng phõn tử progesteron nhỏ (PTL = 314,5 Dal). Vỡ vậy, progesteron muốn trở thành khỏng nguyờn phải gắn với chất mang (Vớ dụ: Albumin huyết thanh) mới cú thể mẫn cảm miễn dịch sinh khỏng thể. Trong trường hợp này, epitope khỏng nguyờn mang tải sẽ ủược trỡnh diện cho tế bào T hỗ trợ CD4 cũn hapten ủược trỡnh diện cho tế bào T hay tế bào B tựy theo nú gõy ủỏp ứng miễn dịch tế bào hay dịch thể (Vũ Triệu An, 1998) [01].
2.3. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong và ngoài nước
Hiện nay cú hai phương phỏp chớnh ủịnh lượng hormon progesteron ủú là phương phỏp ủịnh lượng sinh học và phương phỏp miễn dịch cạnh tranh. Phương phỏp miễn dịch cạnh tranh dựa trờn nguyờn tắc cạnh tranh khỏng nguyờn trong phản ứng liờn kết khỏng nguyờn – khỏng thể. Trong ủú, phương phỏp ủược sử dụng nhiều nhất trong ủịnh lượng miễn dịch enzyme là ELISA,
34
phương phỏp này cho phộp xỏc ủịnh chớnh xỏc và nhanh hormon ở nồng ủộ thấp từ ng/ml ủến pg/ml trong huyết thanh, sữa và nước tiểu.
a- Trờn thế giới
Ứng dụng phương phỏp ELISA, EIA ủể xỏc ủịnh hàm lượng progesteron trong sữa và huyết thanh của gia sỳc cỏi với mục ủớch:
- Xỏc ủịnh hàm lượng progesteron trong thời gian ủộng dục (Maurice. J at al, 1981) [31; (Nakao at al, 1983) [32]; (VanDe Wiel D.F.M at al, 1996) [35]. - Xỏc ủịnh hàm lượng progesteron trong mỏu ủể chẩn ủoỏn cú thai sớm ở lợn (Wu.L.S at al, 1997) [36].
- Xỏc ủịnh hàm lượng progesteron ủể chẩn ủoỏn nguyờn nhõn gõy chậm sinh và ủiều khiển chu kỡ sinh dục ở gia sỳc (Nakao at al, 1983) [32].
b- Trong nước
- Ứng dụng kĩ thuật RIA ủể ủịnh lượng progesteron trong huyết thanh trong cỏc trường hợp bũ cú buồng trứng kộm phỏt triển, bũ bị viờm buồng trứng, bũ cú u nang buồng trứng, buồng trứng cú thể vàng tồn lưu, bũ bị viờm tử cung ủó cho hiệu quả cao, hạn chế thiệt hại cho người nuụi trõu bũ tại khu vực thành phố HCM (Chung Anh Dũng và cộng sự, 2001) .
- Ứng dụng kĩ thuật EIA, ELISA xỏc ủịnh hàm lượng progesteron ủể xỏc ủịnh nguyờn nhõn gõy chậm sinh ủối với bũ cỏi nuụi tại Ba Vỡ và khu vực ngoại thành Hà Nội (Phan Văn Kiểm và cộng sự, 2003) [13].
- ðịnh lượng progesteron trong huyết thanh trõu (Trần Tiến Dũng, 2003)[06] nhằm xỏc ủịnh nguyờn nhõn gõy chậm sinh của gia sỳc cỏi.
36
3. ðễI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.1. ðỐi TƯỢNG
3.1.1. ðộng vật thớ nghiệm
Thỏ dũng Newzealand, chuột nhắt trắng dũng BALB/c.
Thỏ và chuột thớ nghiệm ủược nuụi trong ủiều kiện tiờu chuẩn ở khu chăn nuụi của Viện CNSH.
3.1.2. Dũng tế bào ung thư tủy (Myeloma)
Dũng Sp2/0– Ag14 (gọi tắt Sp2/0) và dũng P3X - Ag18 (gọi tắt P3X) nhận từ ngõn hàng tế bào ATCC (American Type Culture Collection).
3.1.3. Cỏc thiết bị thớ nghiệm
- Tủ nuụi tế bào (Sanyo, Nhật) cú ủiều hũa nhiệt ủộ và CO2 tự ủộng. - Tủ cấy vụ trựng sử dụng ủốn cực tớm và màng lọc 0,25àm. (Microflow, Anh)
- Chai lọ nuụi cấy, pipet cỏc loại của Costar và Corning.
- Kớnh hiển vi soi ngược (Olyimpus, Nhật) với ủộ phúng ủại 5 – 20ì20. - Buồng ủếm tế bào (Newbauer, ðức).
- Mỏy ủo ELISA (Thermo labsystem, ðức). - ly tõm lạnh (Hermje -ðức)
3.1.4. Cỏc húa chất thớ nghiệm
Mụi trường nuụi cấy
- DMEM (Dulbeco Modifie Medium) - RPMI 1640
- FBS (Fetal Bovine Serum)
- HAT (Hypoxanthine aminopterin thimidine) medium
Húa chất thớ nghiệm
- PEG (Polyethylene glycol) -FCA ( Freund complex Adjuvant)
37
Khỏng nguyờn P3- BSA (Progesteron – 3 – (O – carboxymethyl) – oxim – BSA.
Cỏc húa chất này ủều do hóng Sigma, Gybco BRL cung cấp, ngoài ra cũn cú cỏc húa chất thụng thường khỏc.
3.1.5. Thời gian và ủịa ủiểm nghiờn cứu
Thời gian từ 01/01/2008 ủến 30/07/2008
ðịa ủiểm nghiờn cứu: phũng Cụng nghệ tế bào ủộng vật- Viện Cụng nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội.
3.2. NỘI DUNG
3.2.1. ðỏnh giỏ kết quả gõy ủỏp ứng miễn dịch bằng phương phỏp ELISA 3.2.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron 3.2.3. Tỏch dũng tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron 3.2.4. Chọn lọc dũng tế bào sinh khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu và ủộ nhậy cao. 3.2.5. Gõy bỏng cho chuột
3.2.6. Kiểm tra hiệu giỏ khỏng thể
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.1. Gõy miễn dịch cho chuột
Theo phương phỏp của Milstein và Kohler năm (1975), cú cải tiến theo Eryl Liddell và A.Cryer, (2000) [28].
Trộn khỏng nguyờn P3 - BSA với một lượng cựng thể tớch của tỏ dược Freund,s adjuvant cú tỏc dụng làm tăng hoạt tớnh khỏng nguyờn. Lượng P3- BSA ủược pha chế cú nồng ủộ sao cho thể tớch tiờm cho mỗi chuột mỗi lần bằng 0,2ml.
Ban ủầu, chuột cỏi BALB/c (6 tuần tuổi) ủược tiờm dưới da ở 4 vị trớ dọc theo lưng.
Chuột ủược tiờm nhắc lại vào dưới da bụng với cựng một lượng P3 - BSA lỳc 2 và 4 tuần sau lần tiờm thứ nhất. Cỏc mẫu mỏu ủược lấy từ ủuụi
38
hoặc hốc mắt ở cỏc khoảng thời gian sau mỗi lần tiờm bồi và tỏch huyết thanh ủể theo dừi hỡnh thành khỏng thể bằng ELISA. Chuột ủược tiờm bồi lần cuối cựng với lượng P3 - BSA trong 0,1ml dung dịch sinh lớ khụng trộn với tỏ dược vào ven ủuụi lỳc 3 ủến 4 ngày trước khi lấy tế bào lỏch ủể dung hợp với tế bào myeloma.
3.3.2. Phương phỏp lấy ủại thực bào
Theo phương phỏp của Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000)[31] Giết chuột, khử trựng chuột trong cồn 70o. Tiờm vào xoang bụng 3ml dung dịch PBS. Dựng bơm tiờm và hỳt dung dịch trong xoang bụng ra, ủưa vào ống li tõm. Lặp lại như trờn 3 lần. Dịch hỳt ra từ xoang bụng cú chứa tế bào ủược kiểm tra dưới kớnh hiển vi. Cho dịch tế bào li tõm ở tốc ủộ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Sau li tõm, hỳt bỏ dịch nổi, hũa lại cặn (tế bào) với 10 ml dung dịch PBS. Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cựng cặn tế bào ủược hũa trong 1ml DMEM FBS 10%. ðếm tế bào, pha ủiều chỉnh sao cho dịch tế bào cú mật ủộ 103 tế bào/ml, trong mụi trường DMEM 10% FBS.
3.3.3. Phương phỏp lấy tế bào lympho B của chuột
Theo phương phỏp của Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000)[31] Giết chuột ủó ủược gõy miễn dịch bằng P3 - BSA, khử trựng chuột bằng cồn 70o. Tỏch lấy thựy lỏch và cỏc hạch vào ủĩa petri cú sẵn 10ml dung dịch PBS. Dựng kộo cắt lỏch và cỏc hạch thành từng mảnh nhỏ, gạt nhẹ ủể cỏc tế bào rời ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống li tõm, dựng pipet paster hỳt lờn, ủẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. ðể dung dịch lắng cặn, hỳt lấy dung dịch tế bào sang một ống li tõm khỏc. Li tõm dung dịch tế bào ở tốc ủộ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, Sau ủú loại bỏ hết dịch nổi và hũa cặn tế bào trong 10ml PBS. Lặp lại thao tỏc này 3 lần, lần cuối cựng hũa cặn tế bào với DMEM cú bổ sung 10% FBS sao cho cú mật ủộ 108 tế bào/ml.
39
3.3.4. Nuụi cấy tế bào myeloma dũng Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18
a- ðỏnh thức và nhõn nuụi tế bào myeloma:
Chuyển ống tế bào từ trong nitơ lỏng vào cốc nước 36oC – 37oC. Khi dung dịch bờn trong ống cất ủó tan ủỏ hoàn toàn, lau khử trựng phớa ngoài bằng cồn 70o. Chuyển dung dịch bờn trong ống sang một ống li tõm, tiến hành li tõm với tốc ủộ 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Gạn bỏ lớp dịch nổi chứa DMSO. Hũa tan cặn tế bào bằng mụi trường nuụi cấy rồi chuyển tế bào sang chai nuụi cấy thớch hợp. Sau ủú ủể chai nuụi vào tủ ấm 37oC, 5%CO2.
Sau khi tế bào ủược ủỏnh thức thành cụng, phỏt triển bỡnh thường,
khụng bị nhiễm khuẩn, nhõn nuụi ủể ủạt ủược lượng tế bào cần thiết 104- 105
tế bào/ml mụi trường nuụi cấy. Trung bỡnh sau 2- 3 ngày mụi trường phải
ủược thay mới. Vỡ lỳc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phỏt triển tế bào
ủó thay ủổi. Nếu mụi trường khụng ủược thay ủỳng lỳc, tế bào sẽ chết. ðể
thay mụi trường trước hết cần ly tõm, hỳt bỏ mụi trường cũ, tiếp ủú ủưa từ 5-
7 ml mụi trường nuụi cấy phự hợp. ðể tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuụi.
b, Bảo quản tế bào trong lạnh sõu
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trờn 95%, khụng bị nhiễm tạp khuẩn. ðổ bỏ mụi trường cũ thay vào ủú là mụi trường mới, dựng pipet hỳt lờn ủẩy xuống cho tế bào rời ủều trong mụi trường. Hỳt dung dịch tế bào sang ống li tõm, li tõm ở 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Gạn bỏ dịch nổi, hũa cặn tế bào với mụi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào trong ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi ủạt ủược – 25oC thỡ ủưa nhanh ống cất vào lạnh – 70oC, sau 20 giờ chuyển vào bỡnh N2 lỏng.
3.3.5. Dung hợp tế bào và tỏch dũng
Dung hợp: Hỗn dịch tế bào lympho B (nồng ủộ 106/ml) ủược ủưa vào cựng với tế bào myeloma . Sau ủú thờm vào 1ml PEG khuấy kĩ trong 1 phỳt, 5 phỳt sau thờm vào 3,5 ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT và ủ qua ủờm ở 37oC 5%CO2, li tõm hỗn dịch tế bào, hũa cặn vào 30ml mụi trường
40
huyết thanh cú bổ sung HAT và phõn phối vào cỏc giếng của ủĩa nhựa Falcon 0,1ml. Sau dung hợp từ 5 – 7 ngày thờm vào mỗi giếng 0,1 ml mụi trường huyết thanh cú bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi van dựng phản ứng ELISA ủể phỏt hiện khỏng thể mong muốn.
Chọn tế bào từ cỏc giếng cú hiệu giỏ khỏng thể cao ủể tỏch dũng.
Tỏch dũng: Sau khi kiểm tra khả năng tạo khỏng thể bằng ELISA, ta biết ủược giếng nào cú khỏng thể, tuy nhiờn ủõy là khỏng thể ủa dũng do nhiều dũng tế bào lai tạo thành. ðể cú khỏng thể ủơn dũng ta phải tiến hành tỏch dũng như sau:
- Chọn 1 giếng mà dịch nổi cú hiệu giỏ khỏng thể cao nhất trộn ủều cỏc tế bào trong giếng ủó chọn thành hỗn dịch tế bào thuần nhất. Hỳt hỗn dịch tế bào sang ống li tõm cú chứa mụi trường phỏt triển ủể pha loóng tế bào sao cho nồng ủộ chỉ ủạt 1 tế bào/ 100àl.
- Chuyển tế bào ủó pha loóng sang nuụi trong cỏc giếng ủó cú tế bào nuụi, sau ủú chuyển vào nuụi trong tủ ấm CO2 ở ủiều kiện tiờu chuẩn.
- Thay mụi trường cho tế bào 2 ngày một lần.
- Sau khi tế bào phỏt triển tốt (gần kớn ủỏy), kiểm tra lại hiệu giỏ khỏng thể. Chọn ra giếng cú hiệu giỏ khỏng thể cao nhất nhõn lờn với lượng lớn ủể bảo quản hoặc tiờm vào ổ bụng chuột, thu dịch bỏng.
3.3.6. Sản xuất dịch bỏng chuột chứa khỏng thểủơn dũng
Quy trỡnh sản xuất dịch bỏng chuột chứa khỏng thể ủơn dũng với nồng ủộ cao tiến hành theo cỏc bước sau ủõy:
1. Tiờm cho chuột BALb/c 4 tuần tuổi 0,5 ml pristane vào ổ bụng. 2. Sau 14 ngày, tiờm vào ổ bụng mỗi chuột từ 1-3x106 tế bào lai hoà trong PBS 0,01M chứa ion Ca++ và Mg++.
3. Theo dừi chuột khi nào bụng phồng to chứa nhiều dịch bỏng thỡ dựng bơm tiờm vụ trựng hỳt thu hoạch dịch. Sau khi thu hoạch, chuột lại ủược nuụi tiếp ủể tạo dịch bỏng mới. Cú thể thu hoạch dịch bỏng 4 -5 lần từ mỗi chuột.
41
4. Li tõm dịch ở tốc ủộ 2000 v/phỳt 10 phỳt, 4oC. Thu nước nổi ủể làm cỏc bước tiếp theo.
