Phương pháp ELISA

II. Phương pháp hiện đại

2.Phương pháp ELISA

2.1 Nguyên tắc

Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.

Kháng nguyên (Antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit.Cấu trúc kháng nguyên:

 E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K (Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông). Kháng thể ( Antibody ) là protein ﻹ - globulin được sinh ra bởi tế bào lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên

Đĩa giếng ( microplate) là một tấm phẳng với nhiều "giếng" được sử dụng như ống nghiệm nhỏ. Microplate đã trở thành một công cụ tiêu chuẩn trong nghiên cứu phân tích và phòng thí nghiệm thử nghiệm lâm sàng chẩn đoán. Một sử dụng rất phổ biến trong các khảo nghiệm miễn dịch liên kết enzyme ( ELISA), các cơ sở xét nghiệm chẩn đoán y tế hiện đại nhất ở người và động vật.

Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit). Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml(một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104)

II.2Các phương pháp Elisa : 2.2.1 Nguyên tắc

Kháng nguyên ( Antigen ) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên bao gốm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit.Cấu trúc kháng nguyên:

 E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K

(Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông).

Kháng thể ( Antibody ) là protein ﻹ - globulin được sinh ra bởi tế lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên

2.2.2 Các phương pháp Elisa :

2.2.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:

- Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.

- Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.

- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.

- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.

- Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme).

- Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.

- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).

Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KN (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.

2.2.2.2 Sandwich ELISA:

Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):

(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT

(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định

(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán

(6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5)

(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.

(8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.

2.2.2.3. ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN.

(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN.

(3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".

(4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym.

(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu.

Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu. Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT.

2.3. Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa:2.3.1. Phản ứng Elisa gián tiếp: 2.3.1. Phản ứng Elisa gián tiếp:

a. Nguyên liệu:

- Microplate

- Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym peroxidase, bub∆ = trate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ (3,3’ 5,5’ tetramethybenzodine)), PBS,PBS-Tween, Sữa tách bơ(casein).

- Máy đọc phản ứng.

b. Trình tự phản ứng:

- Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trưc tiếp vào đĩa microplate. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.

- Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.

- Bước 3. Gắn kháng thể : 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS-sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.

- Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài : 100µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 5 lần, và đập khô.

- Bước 5. Cơ chất tạo màu : 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phàn ứng có màu vàng.

- Bước 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.

- Kháng nguyên thu hoạch như trên, đươc đo nồng độ protein và giữa ở nhiệt độ -200C.

2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7

o E.coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa trong chuẩn đoán là

kháng nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitop của hai loại kháng nguyên này thường sử dụng để xác định vi khuẩn trong các hệ thống chuẩn đoán huyết thanh.

o Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên lông H7 của loài E.coli .

o Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hướng nhận biết kháng nguyên độc tố Stx1 của E.coli O157:H7.

2.5 Ưu điểm của phương pháp Elisa Ưu điểm:

- Nhanh chóng và thuận tiện .

- Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể .

Nhược điểm:

- Thời gian xét nghiệm lâu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp. - Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng. - Enzyme / chất nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt

3. Phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang

Trong số các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, E.coli O157:H7 được xem là rất nguy hiểm với liều gây độc thấp (10-100 tế bào). Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzym, đầu dò enzym, ELISA, kít chuẩn PCR. Phương pháp phát hiện E.coli O157:H7 trong thực phẩm mang tính pháp lý ở Việt Nam là sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157:H7 trên đĩa thạch SMAC sau khi ủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Từ những khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành kiểm tra các tính chất sinh hóa và ngưng kết đặc hiệu để khẳng định là E.coli O157:H7. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp nêu trên đều không thể phát hiện chính xác số lượng vi khuẩn ở nồng độ thấp. Để khắc phục nhược điểm nêu trên, người ta đã và đang ứng dụng các loại vật liệu nano phát quang như hạt silica chứa tâm màu hay chấm lượng tử QD chứa các nhóm chức năng sinh học trên bề mặt như một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh và chính xác số lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Khâu cốt lõi của kỹ thuật sử dụng hạt nano silica chứa tâm màu là việc chế tạo ra được phức hợp giữa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích với hạt silica phát quang bền vững.

Phức hợp hạt nano silica + kháng thể đặc hiệu có thể được tạo ra bởi nhiều cơ chế khác nhau, hiện nay có 5 cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine–carboxylic; sử dụng SMCC làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết các peptide được gắn histidine hoặc các kháng thể lên các chấm lượng tử được Ni-NIA hóa; gắn kết không hóa trị của hạt nano silica được bọc streptavidin với các kháng thể được biotin hóa biotinylated. Mỗi kiểu gắn kết có những ưu điểm và hạn chế riêng. Nhưng nhìn chung, càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn. Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica, tiến hành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích. Có nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như: quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang; xác định số lượng vi khuẩn (VK) đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của VK gắn hạt nano và số lượng VK trong dung dịch chuẩn. Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu.

Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã chế tạo thành công công thức phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích + hạt nano silica băng cách găn trực tiếp các phân tử kháng thể lên bề mặt hạt silica thông qua liên kết amine-carbonxylic với sự có mặt của chất xúc tác EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) trong

các điều kiện sau: EDAC/1 phản ứng là 0,9mg; tỉ lệ kháng thể với hạt silica là 40/1; thơi gian phản ứng hợp sinh 3 giờ có lắc ngang , nhiệt độ ủ ở 300C.

Phức hợp kháng thể và hạt silica được tạo thành này có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 trong vòng 20 phút, tỉ lệ vi khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạt > 60% và sau 3 ngày vẫn phức hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này đối vối vi khuẩn đích là 102 CFU/ ml, thời gian phát hiện nhanh hơn các phương pháp thông thường nhiều lần.

1. 2.

Ảnh 1: TEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silica Ảnh 2: SEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silica

Hình ảnh SEM (kính hiển vi quét) và kính hiển vi đồng tiêu của tế

bào E.coli O157:H7 được đánh dấu bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica đã chứng

minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và như nhau lên bề mặt tế bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợp sinh với kháng thể vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với hạt nano silica vẫn giữ được hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích

Ảnh huỳnh quang: (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) VK gắn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) VK gắn với phức hợp kháng thể - QDs

Phổ huỳnh quang của phức hợp hạt silica – kháng thể gắn kết với vi khuẩn E. coli O157:H7.

Đây là cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng E.coli O157:H7 để phát hiện nhanh, nhậy số lượng vi khuẩn này ở mật độ thấp

Ảnh huỳnh quang phức hợp Silica – E. coli O157:H7: chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu Nikon C1plus – Ti-E. Viền màu đỏ bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn là phức

KẾT LUẬN

Hiện nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật.

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu dùng chế biến hay thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn. Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli.

Trong thực tế cuộc sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm để hạn chế sự ô nhiễm và tác hại của vi khuẩn trong quá trình thu hoạch các sản phẩm nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình ‘bảo quản chế biến và nấu nướng tới tay người tiêu dùng thường rất phức tạp và gặp nhiều khó khăn.

II. Phương pháp hiện đại

2.Phương pháp ELISA

Mục lục