VIII. Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện
Hình 2.15: Cuvette nhựa có điện cực
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser) (Hình 2.16). Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này có thể được trình bày bằng sơ đồ hình 2.17.
Hình 2.17: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện
Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện
Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di (Hình 2.18).
trên màng bào chất
Lối DNA đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà DNA có thể đi qua.
Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ (Weaver, 1995). Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài. Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, về sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast... Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ
Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này. Hiệu quả biến nạp cao. Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995). Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995). Phương pháp này có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995). Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn. Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995). Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu. Ðiều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết (Weaver, 1995).
Kỹ thuật xung điện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của sinh học phân tử và y học. Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:
- Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein.
- Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào: tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có thể được ủ với một dòng khác không mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong muốn khác. Ðiện áp của xung điện sẽ tạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi ra khỏi tế bào và lại đi vào tế bào khác. Sau đó các tế bào mong muốn sẽ được chọn lọc bằng tính kháng thuốc kháng sinh hoặc bằng
phương pháp tương tự khác (Withers, 1995). Kiểu chuyển gen này cũng có thể được thực hiện giữa các loài khác nhau. Vì vậy, một lượng lớn plasmid sinh trưởng trong các khuẩn lạc vi khuẩn được nhân lên một cách nhanh chóng và sau đó được chuyển vào các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995).
- Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg, 1995).
- Phân phối thuốc qua da: Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất, các lỗ tương tự đã tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía ngoài cùng. Các lỗ này cho phép thuốc đi qua da đến các mô đích. Các bệnh nhân thích phương pháp này hơn phương pháp tiêm (không cần kim tiêm) và có thể tránh được các vấn đề phân hủy hoặc hấp thu không đúng của liệu pháp uống thuốc (oral medication) trong hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993).
- Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): các nhà khoa học đang nghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu quả của liệu pháp hóa học. Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện này sẽ phá vỡ màng tế bào ung thư và làm tăng lượng thuốc đi đến các vị trí. Một số nghiên cứu cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi áp dụng phương pháp này cho các tế bào ung thư ở hệ thống mô hình động vật (Maeda, 1998).
- Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan tâm được biến nạp qua da đến các mô đích. Khi đã hợp nhất vào các tế bào của cơ thể, các protein được tổng hợp từ các gen này có thể thay thế gen sai hỏng và vì vậy đã điều trị các rối loạn di truyền (Hình 2.19)(Inovio, 2002).
Hình 2.19: Ứng dụng của kỹ thuật xung điện trong liệu pháp gen