II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen
1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò (probe), vector và tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và vector thường được sử dụng là plasmid.
Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen
mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp. Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng. Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2).
Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). Hoặc từ sản phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.
Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển
Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hiện một cách tự nhiên. Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen. Dạng cDNA là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã hoá protein của gen.