IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1.2. Khảo sát, tìm điều kiện tối ưu của dung mói rửa giả
Đối với cột chiết pha rắn theo cơ chế trao đổi ion và cơ chế hấp thu pha ngược như cột MAX và cột MCX thì pH, độ phân cực của dung môi rửa giải là rất quan trọng. Vì vậy chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng và tìm pH, độ phân cực tối ưu cho quá trình rửa
Để rửa giải các chất phân tích cần phải chuyển chúng từ dạng anion thành dạng trung hoà nhằm phá vỡ tương tác tĩnh điện giữa chất phân tích với pha tĩnh. Theo quy trình cơ bản dung môi rửa giải là axit focmic/MeOH. Nồng độ axit HCOOH được thay đổi từ 2-10% để xem xét ảnh hưởng của pH tới việc rửa giải chất phân tích.
Hình 10: Sự thay đổi diện tích tín hiệu theo nồng độ axit fom ic trong dung môi rửa giải
Khi tăng nồng độ axit (pH tăng) trong dung dịch rửa giải các chất phân tích ở trạng thái anion chuyển về trạng thái trung hoà tàng nên diện tích tín hiệu tăng. Từ đổ thị trên ta nhận thấy rằng nồng độ axit tối ưu đối vói các FQs là khác nhau điều này là do pKa của chúng khác nhau nên pH tại đó để các chất chuyển hoàn toàn về dạng trung hoà là khác nhau. Do đổng thời phân tích cả bốn cấu tử FQs nên chúng tôi chọn nồng độ axit focmic tối ưu là 6%.
Tìm độ phân cực tối ưu của hệ dung môi rửa gùỉi
Để các chất ảnh hưởng có độ phân cực lớn và nhỏ hơn các FQs không bị rửa giải thì hệ dung môi rửa giải phải có độ phân cực thích hợp, chúng tôi tạo ra các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau bằng cách thêm vào hộ dung môi rửa giải ở trên những lượng H20 khác nhau. Để tìm điều kiện tối ưu của tỉ lệ M e0H /H 20 chúng tôi khảo sát sự thay đổi diện tích các FQs khi tỷlệ M e0H /H 20 làl00/0; 95/5; 90/10; 80/20; 70/30; 60/40 (trong đó nồng độ axit fomic vẫn giữ nguyên 6 %). Kết quả thu
1650 60 70 80 90 100 50 60 70 80 90 100 ♦ NOR O C IP ■ LOM O E N R % MeOH
Hình 11: Sự thay đổi chiều cao tín hiệu theo tỉ lệ M eO tìi H20 trong dung môi rửa giải
Từ kết quả thu được ta nhận thấy rằng khi tăng tỉ lệ M e0H /H 20 chiều cao pic tăng nhung khi đạt 95/5 chiều cao pic lại giảm và lại tăng lên khi tỉ lệ này là 100. Điều này có thể giải thích như sau: khi MeOH/ H20 nhỏ hơn 95/5 thì các chất ảnh hường phân cực hơn các FQs cũng bị rửa giải làm chiều cao pic tăng và khi tỉ lệ MeOH/ H20 lớn hơn 95/5 thì các chất kém phân cực hơn bị rửa giải điẻu này cũng làm diên tích pic tăng. Vì vậy chúng tôi chọn tỉ lệ M e0H /H 20 = 95/5 làm tỉ lệ tối ưu khi phân tích các FQs.
Sự thay đổi của sắc đổ khi thay đổi các điểu kiộn rửa và rửa giải có thể nhận rõ qua hình dưới dây
4.1.2. Tối ưu hoá các bước trong qui trình chiết pha rắn sử dụng cột MCX
Quy trình chiết pha rắn cơ bản sử dụng cột MCX gồm các bước : nạp mảu, rửa chất bẩn lần 1 bằng dung dịch EtOH/Act (99:1), rửa chất bẩn lần 2 bằng MeOH nguyên chất và rủa giải bằng hỗn hợp NH^M eOH/ H20 . Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày kết quả khảo sát lần lư ợ t: thêm một bước rửa lần 3 bằng hỗn hợp NHn/MeOH/ H20 (tỷ lệ dung dịch NH3theo thể tích cố định là 10%, phần trăm MeOH theo thể tích thay đổi từ 5 tói 75%) và tối ưu hoá tỷ lệ thành phần của hỗn hợp NH3/M eOH/ H20 sử dụng trong bưởc rửa giải (% NH3 thay đổi từ 3 tới 13 %, MeOH thay đổi từ 60 tới 90%).
4.1.2.X. Khảo sát bổ sung bước rửa lần 3 bằng hỗn hợp NH^MeOH/ H20
Các chất phân tích (FQs) được chiết khỏi nền mẫu tôm bằng EtOH/Act (99 :1) có pH xấp xỉ 3, do vậy các FQs tổn tại chủ yêú dưới dạng cation (nhóm - N +R 3). Khi nạp vào cột MCX, các FQs sẽ bị giữ lại trên cột tại các vị trí trao đổi cation mạnh mang điện tích âm (nhóm - S 0 3). Cùng với FQs, nhiều chất khác trong mảu cũng được giữ lại trên cột chiết. Trong bưởc rửa lần 1, để loại bỏ các chất ảnh hưởng như protein, muối và khoá các chất phân tích trên cột người ta sử dụng lại EtOH/Act (99 :1). Tiếp theo là bước rửa lần 2 bằng MeOH để loại các axit (không ở dạng ion và các chất trung hoà. Để loại bỏ các chất ảnh hưởng có độ phân cực lớn hơn độ phân cực của các FQs chúng tôi thêm một bước rửa thứ 3. Hộ dung môi dùng cho bước rửa này là hỗn hợp M e0H /H 20 (10% NH3 theo thể tích). Để tìm tỉ lộ tối ưu của M e0H /H 20 (tại đó chất phân tích không bị rửa giải) chúng tôi dùng hỗn hợp trên làm dung môi rửa giải và khảo sát sự phụ thuộc diện tích tín hiệu vào tỉ lệ M e0H /H20 , tỉ lệ M e0H /H 20 tối ưu là điểm cho diện tích tín hiộu nhỏ nhất. Kết quả được biểu diễn trong đồ thị dưới đây
Hình 13 : Sự thay đổi diện tích tín hiệu theo tỉ lệ MeOHIH20 trong dung môi rửa lần 3
Từ dồ thị chúng tôi nhận thấy rằng diện tích tín hiệu nhỏ nhất khi tỉ lệ NH3/M e0 H/H2 0 = 10/5/85. Vì vậy chúng tôi chọn tỉ lệ này Làm tỉ lệ tối ưu cho hệ dung môi rửa lần 3.