Hiện nay, việc định lượng protein đích trong một mẫu phụ thuộc yêu cầu của mục đích định lượng protein mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau. Có hai nhóm phương pháp là định lượng protein đích trực tiếp trong hỗn hợp protein và phương pháp chiết protein đích trước khi định lượng.
Phương pháp định lượng protein trực tiếp trong hỗn hợp thường dùng là phương pháp so màu và phương pháp đo độ hấp thụ UV với kỹ thuật được sử dụng phổ biến là ELISA. Các phương pháp này ít dùng trong nghiên cứu vì độ chính xác chưa cao, thường dùng trong lâm sàng vì quy trình thực hiện đơn giản ngắn gọn và tốn ít thời gian như trong các xét nghiệm và các test thử nhanh không cần độ chính xác cao.
Trong nghiên cứu người ta thường dùng phương pháp thứ hai là chiết tách protein đích từ hỗn hợp protein tổng số trước khi đem định lượng protein đích, các phương pháp tách chiết protein hay dùng là sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ và điện di. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ hay dùng trong hóa phân tích với độ chính xác lên đến pg/mL, đòi hỏi phải hiệu chỉnh máy, chuẩn hóa quy trình, chất chuẩn và toàn bộ máy móc rất đắt tiền. Chính vì vậy mà nó hay được dùng trong nhiều thí nghiệm về tinh sạch và nghiên cứu dược động học trên các dịch sinh học.
Western blot là phương pháp ra đời từ sớm, thuật ngữ này lần đầu đăng tải trên tạp chí Analytical Biochemistry vào tháng 4 năm 1981, kể từ khi ra đời cho đến nay kỹ thuật này ngày càng được cải tiến và hoàn thiện hơn và nó được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử, miễn dịch và các ngành phát hiện protein đích nói chung. Kỹ thuật này cần kinh phí cao và tốn thời gian, đòi hỏi chuẩn hóa, chi tiết nhưng bù lại phương pháp này lại có độ tin cậy cao.
Đề tài sử dụng kỹ thuật Western blot để định lượng mức độ biểu hiện COX-2 trên tế bào RAW264.7 (là đại thực bào có nguồn gốc từ chuột nhắt) với tác nhân kích thích là LPS. Gây viêm cho tế bào RAW264.7 dưới sự kích thích của LPS là phương pháp được sử dụng rộng rãi trên thế giới để nghiên cứu cơ chế tác dụng của thuốc trên các đích phân tử có bản chất là protein. Tác nhân gây viêm tế bào thường được sử dụng là lipopolysaccharid (LPS). LPS có cấu trúc gồm lipid A (phosphoglycolipid) liên kết cộng hóa trị với một heteropolysaccharid thân nước, là thành phần chủ yếu của màng ngoài vi khuẩn gram âm,
42
có khả năng kích thích mạnh các tín hiệu truyền tin trong tế bào và kết quả làm tăng sản xuất COX-2, enzym đặc trưng của phản ứng viêm. Tế bào đại thực bào chuột thường được sử dụng trong các nghiên cứu này, phổ biến nhất là dòng tế bào RAW 264.7. Chứng dương ở đây được sử dụng là indomethacin 0,5 mM là một thuốc thuộc nhóm NSAIDs có cơ chế tác động ức chế tổng hợp enzym COX-2.
Kết quả ở Bảng 3.4 thể hiện ME06 tại nồng độ 100 µg/ml mức độ biểu hiện của COX-2 giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,01), mức độ biểu hiện COX- 2 so với β-actin ở lô ME06 và lô chứng bệnh lần lượt là 0,442; 1,000.
Các thành phần trong chế phẩm nghiên cứu được nhiều nghiên cứu chứng minh công dụng ức chế tổng hợp enzym COX-2 được thực hiện trên dòng tế bào RAW 264.7 gây viêm bởi LPS. Z-ligustilide là thành phần hóa học được phân lập từ dịch chiết đương quy, vào năm 2012 Ji Won Chung và cộng sự tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm của chất này trên in vitro, kết quả cho thấy Z-ligustilide có tác dụng ức chế tế bào RAW 264.7 gây viêm bởi LPS ở các nồng độ là 50 và 100 µM [30]. Năm 2004, nghiên cứu Jing-yuan Wan cho thấy tetramethylpyrazin (thành phần của dịch chiết xuyên khung) có nồng độ 10-4
mol/L có tác dụng ức chế COX-2 trên dòng tế bào RAW 264.7 gây viêm bởi LPS so với lô chứng p<0,05 [31]. Trong thành phần của liễu trắng chứa salicin – một dẫn chất của acid salicylic – khi vào cơ thể chuyển hóa thành acid salicylic có tác dụng ức chế enzym COX. Các nghiên cứu trên cho thấy kết luận ME06 nồng độ 100 µg/ml có tác dụng ức chế COX-2 trên dòng tế bào RAW 246.7 là hoàn toàn có cơ sở. Thử nghiệm này đã giúp giải thích phần nào cơ chế tác động chống viêm, giảm đau của chế phẩm ME06 ở các mô hình chống viêm, giảm đau trên in vivo bên trên do chế phẩm ức chế tổng hợp enzym COX-2. Tuy nhiên trong phạm vi đề tài này chúng tôi mới chỉ đánh giá được tác dụng của mẫu thử ở một nồng độ 100 µg/ml, chưa tiến hành đánh giá được tác dụng của mẫu thử ở các nồng độ thấp hơn, cần tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm trên các nồng độ khác và các đích tác động khác.
43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
Từ hai mục tiêu nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiến hành đánh giá và thu được kết quả như sau:
Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau trên in vivo
1. Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm ME06 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan
Chế phẩm ME06 liều 140 mg/kg có tác dụng giảm mức độ phù bàn chân chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng tại các thời điểm 3 giờ (31,5%; p<0,05), 5 giờ (24,3%; p<0,05).
Chế phẩm ME06 liều 280 mg/kg có tác dụng giảm mức độ phù bàn chân chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng tại các thời điểm 3 giờ (44,9%; p<0,05), 5 giờ (41,5%; p<0,05).
2. Đánh giá tác dụng chống viêm mạn của chế phẩm ME06 trên mô hình gây u hạt trên chuột cống trắng
Chế phẩm ME06 liều 140 mg/kg cân nặng thể hiện tác dụng giảm kích thước u hạt,ướt so với lô chứng (p<0,05) với tỷ lệ giảm khối lượng u hạt ướt là 33,2%. Tuy nhiên, ME06 liều 140 mg không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tác dụng làm giảm kích thước u hạt khô so với lô chứng uống NaCMC (p>0,05).
3. Đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm ME06 trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic
ME06 liều 240 mg/kg cân nặng làm tác dụng giảm đau quặn của chế phẩm rất rõ rệt so với lô chứng (p<0,01). Tác dụng giảm đau của ME06 liều 240 mg/kg cân nặng kéo dài trong 30 phút tính từ khi gây đau bằng acid acetic.
Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng ức chế COX-2 trên tế bào RAW 264.7 của chế phẩm ME06 bằng kỹ thuật Western blot
Đánh giá tác dụng ức chế COX-2 trên tế bào RAW 264.7 của chế phẩm ME06 bằng kỹ thuật Western blot, ME06 ở nồng độ thử 100 µg/ml mức độ biểu hiện của COX-2 giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,01).
44
Sau khi thực hiện xong đề tài, tôi có một số kiến nghị như sau:
- Tiếp tục đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên các mô hình gây viêm cấp khác. - Đánh giá độc tính của chế phẩm ME06 trên thực nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Ngọc Anh (2019), "Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm và độc tính bán trường diễn của cao chiết Ethanol của lá cây Bọ Mẫy (Clerodendrum Cyrtophyllum Turcz., Verbenaceae)".
2. Trịnh Xuân Anh (2020), "Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống viêm, chống dị ứng của viêm hỗ trợ điều trị ECZEMA", pp. 10.
3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Vũ Ngọc Lộ,Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, (2006), "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam", (NXB khoa học và kỹ thuật), tr. 150-152.
4. Bộ môn Dược Cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), "Dược học cổ truyền", NXB Y học, pp.
5. Bộ môn Dược Lực – Trường Đại học Dược Hà Nội (2018), "Thực tập dược lý",
Trường đại học Dược Hà Nội, tr. 2.
6. Bộ môn Dược lý-Đại học Y Hà Nội (2017), "Báo cáo tác dụng dược lý của Thống phong hoàn bà Giằng", Đại học Y Hà Nội.
7. Bộ môn miễn dịch-sinh lý (2012), "Sinh lý Bệnh học", NXB Y học, pp. 209-229. 8. Bộ Y tế (2007), Dược lý học tập 1.
9. Nguyễn Duy Cương, Nguyễn Hữu Quỳnh (1999), "Từ điển bách khoa dược học",
NXB từ điển Bách khoa, tr. 630-632.
10. Nguyễn Văn Dũng, Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Thị Phương, Nguyễn Thùy Dương, (2020), "Nghiên cứu tác dụng chống viêm và giảm đau trên thực nghiệm của cây keo lông chim", Tạp chí Dược liệu, 22, tr. 56-60.
11. Đậu Thị Giang (2016), "Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm của cây gối hạc (Leea rubra blume họ gối hạc Leeaceae) trên thực nghiệm", Trường đại học Dược
Hà Nội.
12. Nguyễn Thị Kim Huế (2019), "Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm, độc tính của chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.), URB.) trên thực nghiệm".
13. Đỗ Thị Thùy Nhân, Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Thị Sơn, (2018), "Đánh giá tác dụng kháng viêm của viên nang Độc Hoạt Ký Sinh thang LĐ trên chuột nhắt trắng",
Tạp chí Y học -TP. Hồ Chí Minh, 22(5), tr. 10-15.
14. Lê Hồng Oanh (2020), Nghiên cứu tác dụng chống viêm thực nghiệm của cao chiết từ vỏ thân cây núc nác (Oroxylum indicum(L.) Vent).
15. Đào Văn Phan (2012), "Các thuốc giảm đau - chống viêm", NXB Y học, tr. 45-47. 16. Nguyễn Thị Phương Quỳnh Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Tân, (2016), "Nghiên
cứu tác dụng chống viêm trong điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt của cốm tan Tiền liệt Thanh Giải trên thực nghiệm", Tạp chí Y Dược học-Trường Đại học Y
Dược Huế, 31, tr. 81-87.
17. Nguyễn Sào Trung, Âu Nguyệt Diệu, Bùi Thị Hồng Khang, Huỳnh Ngọc Linh, Nguyễn Đình Tuấn, Lê Thị Thanh Huyền, Triệu Thị Xuân Thu, (2010), "Bài giảng lý thuyết giải phẫu bệnh", tr. 29-50.
II. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH
18. H Wang, R Chen, H Xu, (1998), "Chemical constituents of radix angelicae sinensis", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 23(3), pp. 167-8, inside backcover.
19. Bhargavi NL Vajja, Suresh Juluri, Manju Kumari, Labonyamoy Kole, Ranjan Chakrabarti, Vishwas D Joshi, (2004), "Lipopolysaccharide-induced paw edema model for detection of cytokine modulating anti-inflammatory agents", Int Immunopharmacol, 4(7), pp. 901-9.
20. Charles A. Winter, Edwin A. Risley, George W. Nuss, (1962), "Carrageenin- induced edema in hind paw of the rat as an assay for antiiflammatory drugs", Proc
Soc Exp Biol Med, 111, pp. 544-7.
21. D O Gonçalves, IBF Calou, RP Siqueira, AA Lopes, LKA Leal, GAC Brito, ARTomé, GSB Viana, (2011), "In vivo and in vitro anti-inflammatory and anti- nociceptive activities of lovastatin in rodents", Braz J Med Biol Res, 44(2), pp. 173- 81.
22. E Okuyama, T Hasegawa, T Matsushita, H Fujimoto, M Ishibashi, M Yamazaki, (2001), "Analgesic components of saposhnikovia root (Saposhnikovia divaricata)",
Chem Pharm Bull (Tokyo), 49(2), pp. 154-60.
23. Earnest Oghenesuvwe Erhirhie, Chika Ndubuisi Emeghebo, Emmanuel Emeka Ilodigwe, Daniel Lotanna Ajaghaku, Blessing Ogechukwu Umeokoli, Peter Maduabuchi Eze, Kenneth Gerald Ngwoke, Festus Basden Gerald Chiedu Okoye, (2019), "Dryopteris filix-mas (L.) Schott ethanolic leaf extract and fractions exhibited profound anti-inflammatory activity", Avicenna J Phytomed, 9(4), pp.
396-409.
24. G Jin, J Li, H Piao, (1992), "Chemical constituents of Ledebouriella seseloides Wolff", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 17(1), pp. 38-40, 64.
25. Guiming Liu, Jing Xie, Yurui Shi, Rongda Chen, Li Li, Mengxue Wang, Meizhu Zheng, Jiaming Xu, (2020), "Sec-O-glucosylhamaudol suppressed inflammatory reaction induced by LPS in RAW264.7 cells through inhibition of NF-κB and MAPKs signaling", Biosci Rep, 40(2), pp.
26. H Süleyman, M E Büyükokuroğlu (2001), "The effects of newly synthesized pyrazole derivatives on formaldehyde-, carrageenan-, and dextran-induced acute paw edema in rats", Biol Pharm Bull, 24(10), pp. 1133-6.
27. J Liu (1995), "Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid", J Ethnopharmacol, 49(2), pp. 57-68.
28. J. Necas, L. Bartosikova (2013), "Carrageenan: a review", Veterinarni Medicina,
58(4), pp. 187–205.
29. Jacquelyn Banasik, Lee-Ellen Copstead (2012), "Pathophysiology", ELSEVIER Saunders, 5, pp. 172-177.
30. Ji Won Chung, Ran Joo Choi, Eun-Kyoung Seo , Joo-Won Nam, Mi-Sook Dong, Eun Myoung Shin, Lian Yu Guo, Yeong Shik Kim, (2012), "Anti-inflammatory effects of (Z)-ligustilide through suppression of mitogen-activated protein kinases and nuclear factor-κB activation pathways", Arch Pharm Res, 35(4), pp. 723-32. 31. Jian-Ying Wang, Xiao-Jun Chen, Lei Zhang, Ying-Yi Pan, Zu-Xi Gu, Shi-Min He,
from Eucommia ulmoides Oliv. against Rheumatoid Arthritis in CIA Rats", Evid Based Complement Alternat Med, 2018, pp. 7379893.
32. Jin Mi Chun, Hyo Seon Kim, A Yeong Lee, Seung-Hyung Kim, Ho Kyoung Kim, (2016), "Anti-Inflammatory and Antiosteoarthritis Effects of Saposhnikovia divaricata ethanol Extract: In Vitro and In Vivo Studies", Evid Based Complement
Alternat Med, 2016, pp. 1984238.
33. Josep T. DiPiro, Robert L. Talbert, Gary C.Yee, Gary R. Malzke, Barbara G. Wells, L. Michael Posey, (2017), Pharmacotheraphy: A Pathophysiologic Approach 10th, pp. 2687-2725.
34. Joseph Schwager, Lidia Gagno, Nathalie Richard, Werner Simon, Peter Weber, Igor Bendik, (2018), "Z-ligustilide and anti-inflammatory prostaglandins have common biological properties in macrophages and leukocytes", Nutr Metab (Lond), 15, pp.
4.
35. Jun Zhao, Tao Liu, Fang Xu, Shuping You, Fang Xu, Chenyang Li, Zhengyi Gu, (2016), "Anti-arthritic Effects of Total Flavonoids from Juniperus sabina on Complete Freund's Adjuvant Induced Arthritis in Rats", Pharmacogn Mag, 12(47), pp. 178-83.
36. Junichi Nagata, Hiroyuki Yokodera, Goki Maeda, (2019), "In Vitro and in Vivo Studies on Anti-Inflammatory Effects of Traditional Okinawan Vegetable Methanol Extracts", ACS Omega, 4(13).
37. Kamel M, Kamel Amany M Gad, Suzan M Mansour, Marwa M Safar, Hala M Fawzy, (2019), "Venlafaxine alleviates complete Freund's adjuvant-induced arthritis in rats: Modulation of STAT-3/IL-17/RANKL axis", Life Sci, 226, pp. 68- 76.
38. Karen Whalen, Richard Finkel, Thomas A. Panavelil, (2016), "Lippincott IIIustrated", Wolters Kluwer Health, 6, pp. 447-469.
39. KF Swingle, FE Shideman (1972), "Phases of the inflammatory response to subcutaneous implantation of a cotton pellet and their modification by certain anti- inflammatory agents", J Pharmacol Exp Ther, 183(1), pp. 226-34.
40. Li Li, Huawu Zeng, Lei Shan, Xin Yuan, Yushan Li, Runhui Liu, Weidong Zhang, (2012), "The different inhibitory effects of Huang-Lian-Jie-Du-Tang on cyclooxygenase 2 and 5-lipoxygenase", J Ethnopharmacol, 143(2), pp. 732-9. 41. Mohd Shara Sidney J Stohs (2015), "Efficacy and Safety of White Willow Bark
(Salix alba) Extracts", Phytother Res, 29(8), pp. 1112-6.
42. Omayma A Eldahshan, Mohamed M Abdel-Daim (2015), "Phytochemical study, cytotoxic, analgesic, antipyretic and anti-inflammatory activities of Strychnos nux- vomica", Cytotechnology, 67(5), pp. 831-44.
43. IASP International Association for the Study of pain (2019), "IASP's Proposed New Definition of Pain Released for Comment on august 7, 2019", IASP-Pain, pp. 44. Rajendra Gyawali, Prapanna Bhattarai, Subodh Dhakal, Brajesh Jha, Sanjeev
Sharma Kattel, Prashamsa Koirala, Ashana Regmi, Sri Krishna Joshi, Tirthamaiya Shrestha, Prem Narayan, Poud (2013), "Analgesic and Anti-inflammatory Properties of Salix alba Linn and Calotropis procera (Aiton) Dryand", International
45. Rajendra Kumar, Sarvesh Singh, Anil Kumar Saksena, Rishi Pal, Riddhi Jaiswal, Rahul Kumar (2019), "Effect of Boswellia Serrata Extract on Acute Inflammatory Parameters and Tumor Necrosis Factor-α in Complete Freund's Adjuvant-Induced Animal Model of Rheumatoid Arthritis", Int J Appl Basic Med Res, 9(2), pp. 100- 106.
46. Salmerón-Manzano Esther, Garrido-Cárdenas José, et al. (2020), "Worldwide Research Trends on Medicinal Plants", International Journal of Environmental Research and Public Health, 17, pp. 3376.
47. Samanta Daliana Golin Pacheco, Alexia Thamara Gasparin, Carlos Henrique Alves Jesus, Bruna Bittencourt Sotomaior, Ana Clara Sans Salomão Brunow Ventura, Daiany Darlly Belo Redivo, Daniela de Almeida Cabrini, Josiane de Fátima Gaspari Dias, Marilis Dallarmi Miguel, Obdulio Gomes Miguel, Joice Maria da Cunha (2019), "Antinociceptive and Anti-Inflammatory Effects of Bixin, a Carotenoid Extracted from the Seeds of Bixa orellana", Planta Med, 85(16), pp. 1216-1224. 48. Shelar PA, Mishra A (2020), "Animal models of inflammation for assessment of
anti-inflammatory drugs", SGVU Journal Of Pharmaceutical Research & Education, 5(2).
49. Shruti Srivastava P Singh, KK Jha, Garima Mishra, S Srivastava, RL Khosa, (2013), "Antiinflammatory, Analgesic and Antipyretic Activities of Aerial Parts of Costus speciosus Koen", Indian J Pharm Sci, 75(1), pp. 83-8.
50. U Snekhalatha, M Anburajan, B Venkatraman, M Menaka, (2013), "Evaluation of complete Freund's adjuvant-induced arthritis in a Wistar rat model. Comparison of