Đánh giá tác dụng chống viêm của chế phẩm ME06 thông qua đánh giá tác dụng ức chế COX-2 trên tế bào RAW 264.7 (tế bào nguồn gốc đại thực bào chuột nhắt) được gây viêm do LPS. Sử dụng kỹ thuật Western blot để bán định lượng COX-2 trong tế bào RAW
264.7 sau khi được ủ với mẫu thử. Tiến hành gồm 6 bước được tóm tắt như sau:
Bước 1: Nuôi cấy tế bào và ủ mẫu thử.
Hoạt hóa tế bào RAW 264.7 từ ống lưu trữ trong nitơ lỏng và nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS, penicillin 100 U/ml, streptomycin 0,1 mg/ml ở tủ ấm 37°C môi trường không khí có 5% CO2. Cấy chuyển tế bào với mật độ 2×105 tế bào/2 ml/giếng vào đĩa 6 giếng và tiếp tục nuôi trong tủ ấm 24 giờ.
Chia các giếng tế bào thành các lô như sau: Lô chứng bệnh, lô chứng dương và lô thử. Gây viêm cho tế bào các lô chứng bệnh, lô chứng dương, lô mẫu thử bằng lipopolysaccharide (LPS).
- Lô chứng bệnh (n=3): Tế bào RAW 264.7 được kích thích viêm bằng LPS và không ủ mẫu thử.
- Lô chứng dương (n=3): Tế bào RAW 264.7 được kích thích viêm bằng LPS và ủ với indomethacin 0,5 mM.
- Lô mẫu thử (n=3): Tế bào RAW 264.7 được kích thích viêm bằng LPS và ủ với các mẫu thử ME06 với nồng độ 100 µg/ml.
Tiếp tục ủ tế bào trong 1 giờ ở tủ ấm 37 °C trong môi trường không khí 5% CO2.
Bước 2: Thu protein và chuẩn bị mẫu protein điện di
Tế bào sau khi ủ xong thì hút bỏ toàn bộ môi trường nuôi cấy, rửa 2 lần với dung dịch PBS (gồm 140 mM NaCl; 1,5 mM KH2PO4; 8,1 mM Na2HPO4.2H2O; 2,7 mM KC; pH 7,4) và bổ sung dung dịch ly giải tế bào (gồm 25 mM Trisbase; 150 mM NaCl; 0,5% natri
28
deoxycholate; 0,1% SDS; 1% Triton X-100 và hỗn hợp các chất ức chế các enzym protease). Gõ lắc nhẹ trong 5 phút, cạo bề mặt nuôi cấy bằng que cạo tế bào. Chuyển toàn bộ dịch trong các giếng vào các ống ly tâm. Ly tâm lạnh 4°C trong 15 phút với tốc độ 14.000 vòng/phút, hút lấy dịch nổi phía trên chứa protein toàn phần. Toàn bộ quy trình thu protein được thực hiện trong phòng mát, đĩa tế bào được đặt trên đá lạnh trong quá trình thao tác ly giải để hạn chế sự phân hủy protein. Định lượng protein toàn phần bằng Bradford và điều chỉnh nồng độ protein toàn phần trong các mẫu dung dịch thu được đều bằng 2,5 kg/mL.
Biến tính protein: Lấy 40 µL mẫu dung dịch chứa protein toàn phần trộn với 10 µl dung dịch tải mẫu (gồm glycerol 50%, SDS 10%, mecarptocthanol 25%, bromophenol blue 0,05%). Đun nóng hỗn hợp này ở 95°C trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút thu lấy dịch nổi được mẫu protein để điện di.
Bước 3: Điện di protein để phân tách hỗn hợp protein
Làm sạch khuôn gel bằng cồn 70°C, cho khuôn gel vào giá đỡ. Dùng pipet tra nhẹ nhàng dung dịch resolving gel vào khuôn sao cho bề mặt trên của khối gel cách mặt thoáng 2 cm. Nhỏ lên trên bề mặt resolving gel một lớp dung dịch isopropanol, đợi gel đông khoảng 20 phút ở điều kiện thường. Hút bỏ toàn bộ lớp isopropanol, dùng giấy thấm để thấm thật sạch, rồi dùng pipet tra nhẹ nhàng dung dịch stacking gel lên trên bề mặt resolving gel đã đông và cài lược vào phần stacking gel vừa đổ. Đợi 15 phút để stacking gel đông hoàn toàn, tháo lược. Vết hằn trên stacking gel do lược lưu lại chính là các giếng gel để tra mẫu protein.
Chuẩn bị dung dịch stacking gel và resolving gel theo công thức sau:
Bảng 2.2. Thành phần stacking gel và resolving gel
Hóa chất Thành phần stacking gel (µl) Thành phần resolving gel (µl) Bis-Acrylamid 40% 2 000 2 000 Nước cất 3 800 5 600 Tris base pH 8,8 1,5M 2 000 2 500
29
SDS 10% 80 200
APS 10% 80 50
Teemed 8 5
Tháo khuôn gel ra khỏi giá đỡ, đặt vào trong bình điện di, đổ dung dịch chạy điện di (gồm glycin 14,4 g, Trisbase 3,03 g, SDS 1g, nước đủ 1L) cho ngập gel. Hút 20 µL mẫu protein điện di tra vào các giếng. Cắm các đầu nguồn điện, chạy nguồn 1 chiều chế độ không tải với hiệu điện thế 50V trong 5 phút cho ổn định, sau đó chạy 180V trong 120 phút.
Bước 4: Chuyển màng
Áp bản gel tiếp xúc trực tiếp với màng nitrocellulose, sau đó kẹp thêm các tấm giấy lọc, miếng bọt biển và cặp lại. Cặp được lắp vào bình điện di đổ ngập dung dịch chuyển màng, chạy với điện thế 90V trong 150 phút. Sau khi chạy máy 150 phút, màng được rửa 3 lần x 5 phút/lần với dung dịch rửa màng TBS-T 1X (gồm 6,06 g Trisbase; 8,76 g NaCl; Tween 20 với thể tích 1mL, nước vừa đủ 1L, pH 7,4).
Bước 5: Phong bế màng
Ủ màng với dung dịch sữa gầy trong 1h trên máy lắc. Đổ bỏ dung dịch sữa gầy, rửa màng 3 lần với dung dịch TBS-T 1X với 3 lần × 5 phút/lần.
Bước 6: Nhận biết các protein đích trên màng và đọc kết quả.
Ủ màng với kháng thể sơ cấp (anti COX-2) trong 24h ở 4°C trên máy lắc. Sau đó, thu lại dung dịch kháng thể sơ cấp, rửa màng bằng TBS-T 1X trong 3 lần × 10 phút/lần. Ủ màng với kháng thể thứ cấp (anti rabbit) trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc. Sau đó thu lại dung dịch kháng thể thứ cấp, rửa màng bằng TBS-T 1X trong 3 lần × 10 phút/lần.
Đọc kết quả: Nhỏ dung dịch ECL Prime gồm dung dịch luminol (solution A) và dung dịch peroxide (solution B) lên trên màng, để 5 phút để HRP xúc tác cho phản ứng giữa luminol và peroxide, xuất hiện ánh sáng quang học được thu lại bằng cách áp màng qua màng bọc nilon (để tránh dung dịch ECL Prime làm hỏng film) trên film X-quang. Thao tác thu tín hiệu và rửa với film X-quang được thực hiện trong phòng tối. Mật độ quang được phân tích và xử lý bằng phần mềm ImageJ.
30
Lượng COX-2 và β-actin tỷ lệ với mật độ độ tín hiệu quang học thu được của các dải protein tương ứng trên film X-quang. Mục đích sử dụng của β-actin với vai trò protein đối chứng là để kiểm soát sự đồng đều về lượng mẫu giữa các giếng, và xác nhận hiệu quả của quá trình chuyển màng. Tỷ số mật độ quang protein đích (COX-2) so với mật độ quang protein đối chứng (β-actin). Từ đó so sánh lượng protein đích giữa các lô với nhau để rút ra sự ảnh hưởng của mẫu thử lên biểu hiện của protein đích. Mật độ quang được phân tích và xử lý bằng phần mềm ImageJ.