4.1.1. Về tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm ME06
Trong nghiên cứu này lựa chọn mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan để đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm ME06. Mô hình được Winter và cộng sự khởi xướng vào những năm 60 của thế kỷ trước [55], nó được được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế thế giới. Mô hình gây phù chân chuột được đánh giá là mô hình cơ bản, đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp và độ chính xác tương đối cao. Cho tới nay nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân gây viêm trên chân chuột khác nhau như carrageenan, lipopolysaccharid [19], formaldehyd [26], albumin trứng [23]…
Carrageenan là một polysaccharid, được chiết xuất từ tảo biển khi tiêm vào bàn chân chuột, carrageenan đóng vai trò là một dị nguyên kích thích hàng rào miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể chuột như đại thực bào, bạch cầu đa nhân trung tính, chúng tập trung đến để thực hiện quá trình thực bào và kèm theo đó giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, các kinin…, gây ra hiện tượng sưng (phù), nóng, đau [51]. Quá trình viêm gây ra bởi carrageenan diễn ra gồm hai giai đoạn, giai đoạn thứ nhất (từ 0-2 giờ ngay sau khi gây tiêm carrageenan) liên quan đến giải phóng histamin, serotonin và bradykinin, giai đoạn hai (2-6 giờ sau khi tiêm) giải phóng prostaglandin, nitric oxid và có sự thâm nhập, hoạt hóa bạch cầu trung tính. Các dấu hiệu của viêm xuất hiện, trong đó phù nề thể hiện rõ nhất ở giai đoạn cuối (đặc biệt vào thời điểm 3-5 giờ sau khi tiêm carrageenan) [28], [59]. Tác nhân carrageenan là lựa đầu tay của các nhà khoa học khi tiến hành thực nghiệm trên mô hình gây phù chân chuột vì các lý do sau: Tình trạng viêm do carrageenan tạo ra cấp tính và có thể tái tạo được, tác nhân này gây viêm bằng nhiều cơ chế kiến cho nó là lựa chọn đầu tiên để sàng lọc các thuốc thử chống viêm, phản ứng viêm do carrageenan tạo ra có hai pha do đó cho phép dự đoán các đích tác động mà thuốc thử hướng tới [48]. Chính vì vậy trong thử nghiệm này, nhóm nghiên cứu sử dụng tác nhân gây viêm là carragenan và đánh giá tác dụng chống viêm cấp ở các khoảng thời gian 1giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ sau khi gây tiêm carrageenan.
Chế phẩm ME06 được đánh giá tác dụng chống viêm cấp với hai mức liều 140 mg/kg cân nặng và 280 mg/kg cân nặng (hai mức liều này dựa trên liều quy đổi tương đương trên
37
người và chuột cống trắng trong điều trị viêm cấp) [5]. Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid (dẫn xuất từ acid phenylacetic) có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt nhanh theo cơ chế ức chế enzym COX [15].
Kết quả của Bảng 3.1 thể hiện ME06 tại hai mức liều 140 mg/kg và 280 mg/kg có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột tại các thời điểm 3 giờ, 5 giờ (p<0,05). Tỷ lệ ức chế phù bàn chân chuột với mức liều 140 mg/kg tại các thời điểm 3 giờ, 5 giờ lần lượt là 35,1%; 24,3%. Tỷ lệ ức chế phù bàn chân chuột với mức liều 280 mg/kg tại các thời điểm 3 giờ, 5 giờ lần lượt là 44,9%, 41,5%.
Các dược liệu và thành phần có trong chế phẩm ME06 có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống viêm cấp trên thực nghiệm.
Tetramethylpyrazin và acid ferulic là hai hoạt chất được phân lập từ rễ cây xuyên khung và acid ferulic có trong rễ đương quy [3], [60]. Nghiên cứu của Y Ozaki vào năm 1992 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan kết quả cho thấy tetramethylpyrazin liều 100 mg/ngày ức chế phù tại thời điểm 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ với tỷ lệ giảm phù lần lượt là 12,0%; 13,4%; 17,3%; 20,0%; 19,3%; 17,3% (p<0,05 tại 30 phút, 1 giờ; p<0,01 tại 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ), acid ferulic liều 300 mg/kg có tác dụng ức chế phù tại thời điểm 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 6 giờ với tỷ lệ giảm phù lần lượt là 17,3%; 12,5%, 13,0%; 12,7%; 9%; 8,9% (p<0,01 tại 30 phút và p<0,05 tại 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 6 giờ) [60].
Từ xa xưa liễu trắng coi là thần dược dùng để hạ sốt giảm đau, chống viêm trên thế giới [3]. Nghiên cứu Rajendra Gyawali và các cộng sự vào năm 2013, dịch chiết liễu trắng liều 93,5 mg/kg có tác dụng ức chế phù trên mô hình gây phù chân chuột bằng formalin tại thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ với tỷ lệ giảm phù lần lượt là 25,9%; 19,0%; 27,4%, 33,3%; 33,3% (p<0,05 tại các thời điểm) [44].
Trong nghiên cứu của Chun vào năm 2016 cho thấy dịch chiết phòng phong liều 200 mg/kg cân nặng có tác dụng ức chế viêm khớp trên mô hình gây viêm khớp ở chuột bằng monosodium iodoacetate (MIA) so với lô chứng (p <0,05) [32].
Từ các nghiên cứu trên, có thể kết luận rằng tác dụng chống viêm cấp của ME06 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan là hoàn toàn có cơ sở. Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá tác dụng chống viêm mạn trên 1 mức liều 140mg/kg cân nặng đối với chuột cống và tác dụng giảm đau 240 mg/kg cân nặng đối với
38
liều trên chuột nhắt trắng và đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 trên dòng tế bào RAW 264.7.
4.1.2. Về tác dụng chống viêm mạn của chế phẩm ME06.
Đánh giá tác dụng chống viêm mạn của chế phẩm ME06 liều 140 mg/kg trên mô hình gây u hạt thực nghiệm với thuốc đối chứng là prednisolon liều 5 mg/kg.
Nhóm nghiên cứu lựa chọn mô hình gây u hạt trên chuột vì đây là mô hình đơn giản, dễ thực hiện, kết quả đáng tin cậy, khi phân tích sinh hóa của u hạt còn giúp cung cấp thêm thông tin các thay đổi chức năng trong viêm mạn tính, mô hình này thường được sử dụng để đánh giá các loại thuốc chống viêm mới [48].
Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu này là khi đưa vào cơ thể vật lạ không có khả năng hấp thu như cotton, amian…, cơ thể sẽ phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào đi đến nơi có vật lạ được cấy vào trong đó chủ yếu là đại thực và bạch cầu đa nhân trung tính để tiêu diệt vật thể lạ và giải phóng chất trung gian hóa học gây viêm. Vật thể lạ không thể tiêu diệt được và viêm lâu ngày dẫn đến hình thành các mô bào lưới và các sợi bao quanh vật lạ tạo thành một khối u gọi là u hạt thực nghiệm. Sử dụng bông tẩm carrageenan 1% để gây viêm có những ưu điểm sau: Dễ tạo hình dáng kích thước, dễ bóc tách, rẻ tiền và dễ kiếm.
Quá trình tăng sinh tế bào u hạt khi cấy viên bông dưới da chuột được mô tả qua ba giai đoạn. Giai đoạn 1 là giai đoạn thẩm thấu (transudative phase) có sự gia tăng khối lượng ướt của viên bông trong 3 giờ đầu tiên, giai đoạn 2 (exudative phase) là giai đoạn thoát dịch, được định nghĩa là sự rỉ dịch từ dòng máu, từ tế bào bị viêm xung quanh u hạt tiết ra và xảy ra ngay sau 3-72 giờ sau khi cấy bông, giai đoạn thứ 3 (proliferative phase) là giai đoạn tăng sinh được đo bằng sự gia tăng trọng lượng khô của u hạt xảy ra từ 3-6 ngày sau khi cấy bông [39]. Vì vậy, nhóm nghiên cứu được tiến hành trong 7 ngày để đánh giá tác dụng chống viêm mạn của chế phẩm ME06 liều 140 mg/kg. Nhóm nghiên cứu sử dụng mức liều trê chuột cống trắng 140 mg/kg mức liều này dựa trên mức liều quy đổi tương đưogn trên người và chột cống trắng [5].
Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.2 thể hiện chế phẩm ME06 liều 140 mg/kg cân nặng thể hiện tác dụng giảm kích thước u hạt ướt so với lô chứng (p<0,05) với tỷ lệ giảm khối lượng u hạt ướt là 33,2%. Tuy nhiên, ME06 liều 140 mg/kg không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tác dụng làm giảm kích thước u hạt khô so với lô chứng uống NaCMC
39
(p>0,05). Khối lượng u hạt ướt liên đến quá trình tiết dịch tiết của vùng mô bị viêm và dịch dừ mao mạch đi đến, còn khối lượng u hạt khô liên quan đến quá trình hình thành mô u hạt [48]. Chế phẩm ME06 ở mức liều 140 mg/kg cho thấy tác dụng ức chế tiết dịch, chưa thấy tác dụng ức chế tăng sinh mô trong quá trình viêm mạn so với lô chứng (p>0,05).
Tetramethylpyrazin và axit ferulic có trong trong dịch chiết đương quy và xuyên khung, nghiên cứu của Y Ozaki vào năm 1992, tetramethylpyrazin ở hai mức liều là 30mg/kg, 100mg/kg và acid ferulic ở mức liều 300 mg/kg có tác dụng giảm kích thước u hạt khi cân khô khi so với lô chứng (p<0,05), tỷ lệ giảm kích thước u hạt khô của tetramethylpyrazin ở hai mức liều là 30mg/kg, 100mg/kg lần lượt là 33,4%; 64,4% và tỷ lệ giảm kích thước u hạt khô của acid ferulic liều 300 mg/kg là 54,0% [60].
Nghiên cứu của Xiaorong Li vào năm 2013, dịch chiết độc hoạt với ethanol 60% và ethanol 80% liều đều là 1,5 g/kg làm giảm kích thước u hạt khô so với lô chứng (p<0,05) với tỷ lệ giảm kích thước u hạt lần lượt là 31,8%; 27,9% [58].
Từ các nghiên cứu trên cho thấy các dược liệu trong của thành phần chế phẩm ME06 có tác dụng giảm làm giảm khối lượng u hạt khô trên mô hình gây u hạt thực nghiệm. Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của ME06 liều 140 mg/kg trên chuột cống trắng chỉ cho thấy tác dụng giảm kích thước u hạt ướt nhưng chưa thấy giảm kích thước u hạt khô so với lô chứng.
4.1.3. Về tác dụng giảm đau của chế phẩm ME06
Đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm ME06 bằng mô hình gây đau quặn trên chuột nhắt với thuốc đối chứng là diclofenac liều 20 mg/kg. Chế phẩm ME06 liều 240 mg/kg dựa trên mức liều quy đổi tương đương trên người và chuột nhắt trắng trong điều trị giảm đau [5].
Mô hình này đánh giá là đơn giản, dễ thực hiện, dùng đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi của các thuốc nghiên cứu tuy nhiên tính chính xác chưa cao vì phụ thuộc vào người quan sát. Để khắc phục nhược điểm việc đếm số cơn đau quặn, trong quá trình thực nghiệm chúng tôi đã không chỉ đếm trực tiếp mà còn quay video sau đó chỉ cho 1 người đếm tránh sai số chủ quan do nhiều người đếm.
Tác nhân gây đau ở đây dùng là acid acetic, acid acetic là tác nhân gián tiếp gây giải phóng bradykinin, serotonin, histamin và các prostaglandin, chính những chất này gây ra đáp ứng đau quặn. Ribeiro và cộng sự cho rằng tác dụng gây đau quặn bởi acid acetic phụ
40
thuộc vào việc sản xuất và phát hành các cytokin gây viêm là: TNF-α, IL-1β và IL-6 và các prostaglandin [12]. Tác dụng giảm đau quặn của ME06 có thể do sự ức chế sự tổng hợp của một số chất trung gian gây viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6, và PGE2.
Kết quả ở Bảng 3.4 thể hiện diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng làm giảm số cơn đau quặn so với lô chứng (p<0,01 mỗi 5 phút trong 20 phút đầu sau khi tiêm acid acetic và p<0,05 ở khoảng thời gian từ phút 20 đến phút 25). Tác dụng giảm đau của diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng kéo dài trong 25 phút đầu tính từ khi gây đau bằng acid acetic. ME06 liều 240 mg/kg cân nặng làm tác dụng giảm đau quặn của chế phẩm rất rõ rệt so với lô chứng (p<0,01). Tác dụng giảm đau của ME06 liều 240 mg/kg cân nặng kéo dài trong 30 phút tính từ khi gây đau bằng acid acetic. Chế phẩm ME06 ở liều 240 mg/kg có tác dụng giảm đau tốt hơn diclofenac liều 20 mg/kg.
Để giải thích cho tác dụng giảm đau của chế phẩm ME06 là do thành phần trong chế phẩm gồm các dược liệu mà dân gian dùng để điều trị giảm đau, cho đến nay có nhiều nghiên cứu chứng minh công dụng giảm đau của chúng.
Vào năm 2013, nghiên cứu của Rajendra Gyawali cho thấy dịch chiết liễu trắng ở các mức liều 62,5 mg/kg và 93,5 mg/kg làm giảm cơn đau so với lô chứng (p<0,05) có tần suất xuất hiện cơn đau sau 30 phút lần lượt là 1,2±0,89 và 0.6±0.54, như vậy tăng liều liễu trắng tăng lên giúp tăng tác dụng giảm đau quặn [44].
Vào năm 1992, nghiên cứu của Y Oaki về tetramethylpyrazin liều 100 mg/ngày và acid freulic liều 300 mg/ngày (chất phân lập từ dịch chiết xuyên khung và độc hoạt) có khả năng làm giảm các cơn đau quặn gây ra bởi acid acetic khi so sánh với lô chứng (p <0,01) [60]. Nghiên cứu của Xiaorong Li vào năm 2013, dịch chiết độc hoạt với ethanol 60% có tác dụng giảm đau so với lô chứng (p<0,05) với số cơn đau quặn trung bình trong 60 phút là 10,3 [58]. Trong nghiên cứu của Okuyama vào năm 2001 thấy tác dụng giảm đau của dịch chiết rễ phòng phong ở liều 2 g/kg và 3 g/kg trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic [22].
Từ các nghiên cứu trên cho thấy, chế phẩm ME06 có tác dụng giảm đau trên mô hình thực nghiệm là có cơ sở. Việc kết hợp các dược liệu có tác dụng giảm đau giúp chế phẩm ME06 đạt được hiệu quả giảm đau tốt. Nghiên cứu gợi ý chế phẩm có thể dùng thuốc trong điều trị đau như đau xương khớp, đau do gút…, cần tiến hành thêm nghiên cứu giảm đau trên các mô hình gây đau khác và thử tác dụng giảm đau trên lâm sàng.
41