Hình 1.6. Hình ảnh toàn cây, hoa và quả hồng [43]
Hồng có tên khoa học là Diospyros kaki Thunb. thuộc họ Thị (Ebenaceae). Cây to, lá mọc so le, hình trứng hay trái xoan, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có lông tơ. Cụm hoa mọc ở kẽ lá, màu vàng nhạt; quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, nhẵn,
19
phẳng hoặc có sống dọc, khi chín màu vàng hoặc đỏ; hạt dẹt, màu nâu vàng hoặc nâu đen. Cây có nguồn gốc bản địa từ Trung Quốc và đã được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt của Đông Á như Hàn Quốc, Nhật Bản [1]. Trong lá hồng, flavonoid là thành phần chính và tạo ra hoạt tính sinh học chủ yếu. Chúng được chia thành 2 loại là flavonol và flavonol glucosid. Một số flavonoid có thể kể đến như quercetin, isoquercetin, kaempferol, astragalin, myricitrin. Ngoài ra còn có các terpenoid như oleanolic acid, ursolic acid, và các hợp chất khác là: resin, polysaccharid, chlorophyl, caroten, kryptoxanthin, cellulose,… [1], [43].
Theo y học cổ truyền, quả hồng chín có vị ngọt, hơi chát, tính bình, có tác dụng nhuận phế, trừ đờm, khỏi ho, sinh tân dịch. Tai hồng có vị đắng, chát, tính ấm, vào kinh vị, có tác dụng ôn trung, hạ khí, làm giáng khí nghịch xuống. Quả hồng chín để ăn, chữa suy dinh dưỡng, háo khát, ho đờm. Hồng chín phơi khô chữa trĩ, táo bón. Tai hồng chữa nấc, đầy bụng, đau bụng lạnh, nôn mửa, đái dầm. Thị sương (Saccharum kaki) là chất đường trong quả hồng chín, ép lấy nước hoặc khi làm mứt nước chảy ra, cô nhỏ lửa thành đường, đổ khuôn, cắt ra phơi khô dùng chữa đau bụng, họng khô, ho.
Từ lâu, lá hồng đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như đột quỵ thiếu máu cục bộ, đau thắt ngực, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, … Rất nhiều các nghiên cứu trên dịch chiết và các chất phân lập từ dịch chiết đã cho thấy các tác dụng dược lý phong phú như chống oxy hóa, chống viêm, cầm máu, hạ lipid máu, và các lợi ích trên tim mạch. Chính vì vậy, nó được coi là một liệu pháp tiềm năng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh xơ vữa, đái tháo đường, tăng huyết áp [43]. Trong các thử nghiệm in vivo
và in vitro, lá hồng cũng cho thấy tác dụng bảo vệ chống lại các tổn thương do thiếu máu cục bộ não, tái tưới máu. Naoxingqing (NXQ - dịch chiết chuẩn giàu flavonoid từ lá hồng) là một bài thuốc đã được cấp bằng sáng chế và chấp thuận sử dụng tại Trung Quốc để điều trị đột quỵ thiếu máu cục bộ. Sử dụng NXQ cho chuột trên mô hình gây tắc động mạch não giữa cho thấy sự giảm thể tích nhồi máu, giảm phù não và giảm các yếu tố gây viêm [6]. Thành phần flavonoid trong lá hồng cũng cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh: chúng ức chế sự hình thành các gốc oxy hoạt động ROS, tăng cường dọn ROS và giảm các tổn thương ở tế bào thần kinh [6], [30]. Liều cao dịch chiết flavonoid giảm phản ứng viêm và tổn thương nội mô mạch máu tương tự như ginaton (cao lá bạch quả) [31]; các terpenoid saponin trong lá hồng cũng cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh trên mô hình gây tổn thương cho các tế bào u nguyên bào thần kinh đệm do H2O2 [51].
20
CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu – thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Bảng 2.1. Danh sách các hóa chất sử dụng
Tên hóa chất Xuất xứ
Minimum essential medium GIBCO, Rockville, MD, USA Heat-inactivated horse serum GIBCO, Rockville, MD, USA Penicillin-G, Streptomycin sulfat GIBCO, Rockville, MD, USA B-27 supplement GIBCO, Rockville, MD, USA N-Methyl D-aspartic acid (NMDA) ACROS Organics™, India
MK-801 hydrogen maleat (MK-801) Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA
D-glucose Trung Quốc
2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ
Bảng 2.2. Danh sách máy móc, thiết bị, dụng cụ
Tên máy móc, thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
Máy cắt McIlwainTM tissue chopper Mickle laboratory engineering Co. Ltd., Surrey, UK
Màng lọc Omnipore membrane filter JHWP02 500; Merck millipore, Bedford, MA Tủ an toàn sinh học Telstar model Bio-II-A, AZBIL TELSTAR
Tủ nuôi cấy Sanyo, Nhật Bản
Phần mềm Image-J software ver. 1.41, NIH; Bethesda, MD, USA Đĩa nhựa có hình dạng doughnut GIBCO, Rockville, MD, USA Kính hiển vi Olympus IX73 Olympus Inc., Tokyo, Japan
21
Hình 2.1. (A) Máy cắt McIlwainTM Tissue Chopper. (B) Tủ an toàn sinh học Telstar. (C) Tủ nuôi cấy. (D) Kính hiển vi Olympus IX73. (E) Màng lọc omnipore trên đĩa doughnut
2.1.3. Nguyên liệu nghiên cứu
- Cao chiết cồn rễ củ tam thất. - Cao định chuẩn lá hồng.
- Cao chiết cồn quả dành dành và đơn thành phần geniposid. - Cao định chuẩn rễ ngưu tất.
2.2. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt non chủng Swiss albino 5 - 7 ngày tuổi do Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột được nuôi trong phòng chăn nuôi ở điều kiện duy trì nhiệt độ 25 ± 1 oC với độ ẩm 65 ± 5 % và chu kỳ 12 giờ sáng-tối (sáng từ 6:00 - 18:00). Thức ăn và nước uống được cung cấp theo nhu cầu.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị cao chiết
Các mẫu dược liệu được thu hái tại một số tỉnh thành trong nước và được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu. Các mẫu nghiên cứu được sấy tiếp ở 50 oC đến khô, sau đó cất trong túi nilon kín, tránh ẩm, bảo quản nơi khô ráo.
22
Mẫu thử dành dành (cao GJ)
Cao chiết được chuẩn bị tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu theo phương pháp đã được công bố trước đây [46]. Quả dành dành được thu mua ở tỉnh Bắc Ninh, 100 g quả dành dành khô được xay thành bột mịn và chiết hồi lưu 3 lần với ethanol 50 % (Lần 1: 700ml ethanol 50 % trong 2 giờ; Lần 2: 500ml ethanol 50 % trong 1,5 giờ; Lần 3: 500ml ethanol 50 % trong 1 giờ), lọc dịch chiết sau mỗi lần. Dịch chiết được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 50 oC. Cao chiết được sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 50 oC đến khối lượng không đổi, thu được cao chiết với hiệu suất là 32,4 %. Dựa vào phân tích HPLC, hàm lượng geniposid trong cao chiết ethanol 50 % quả dành dành được ước định là 11,70 ± 0,04 %.
Mẫu thử tam thất (cao PNG)
Cao tam thất được chuẩn bị tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu theo phương pháp đã được công bố trước đây [45]. Rễ củ tam thất được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 oC và sau đó nghiền thành bột mịn. Bột dược liệu được chiết hồi lưu 2 lần (tỷ lệ dung môi/dược liệu = 7/1) trong thời gian 2 giờ sử dụng ethanol 70 %. Dịch chiết được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm ở 50 oC. Cao chiết được sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 50 oC để thu được cao khô. Hiệu suất chiết cao tam thất là 28,02 %. Cao được bảo quản ở 4 oC đến khi được dùng để nghiên cứu tác dụng dược lý. Dựa vào phương pháp HPLC, cao chiết tam thất được xác định là có chứa 15,86 % Rg1 và 12,04 % Rb1.
Mẫu thử lá hồng (cao DKF)
Cao định chuẩn lá hồng được chuẩn bị tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu và được chuẩn bị theo phương pháp đã được công bố trước đây [29]. Lá hồng được thu hái tại tỉnh Lạng Sơn. Mẫu lá hồng sau khi sấy khô ở 40 – 50 oC, được xay nhỏ để có kích thước từ 2 – 5 mm. Dược liệu được chiết với ethanol 70 % ba lần liên tiếp với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 10/8/8 (ml/g) tương ứng cho 3 lần. Thời gian chiết lần lượt là 2h/1,5h/1h. Dịch chiết được gộp lại từ 3 lần, cô bớt dung môi về dịch chiết có nồng độ cồn tương đương 40 %. Dịch chiết này sau đó được hấp phụ lên cột chứa hạt nhựa D101. Sau khi hấp phụ xong rửa bằng ethanol 30 % đến khi nhạt màu. Cột được rửa giải bằng ethanol 60 %. Dịch chiết ethanol 60 %, sau khi thu hồi bớt dung môi, được cô cách thủy đến cao đặc và sấy cao ở 50 oC đến khi thu được cao khô có hàm hượng flavonoid đạt 21 % (định lượng HPLC), độ ẩm cao chiết < 5 % (cao DKF).
23
Mẫu thử ngưu tất
Cao định chuẩn ngưu tất được cung cấp bởi Khoa Công nghệ chiết xuất, Viện Dược liệu. 4 kg rễ ngưu tất được chiết ngâm lạnh bằng ethanol 80 % 3 lần, mỗi lần 24 giờ. Dịch chiết cồn được gộp lại và được cô thu hồi dung môi dưới áp suất còn lại 1/10 thể tích dịch. Dịch cô đặc được phân tán trong nước và hấp phụ trên cột nhựa D101. Hạt sau quá trình hấp phụ được rửa giải loại tạp bằng dung môi nước và ethanol 20 % sau đó rửa giải bằng dung môi ethanol 50 % thu được 89 g cao có hàm lượng saponin tổng đạt 40,24 % (định lượng bằng phương pháp UV theo acid oleanoic).
2.3.2. Nuôi cấy lát cắt hồi hải mã (Organotypic hippocampal slice culture - OHSCs)
Thu lấy não bộ của chuột nhắt non chủng Swiss albino 5 - 7 ngày tuổi. Sau đó, vùng hồi hải mã của não bộ nhanh chóng được phân lập trong môi trường phù hợp và được cắt thành từng lát có độ dày 450 μm sử dụng máy cắt McIlwain tissue chopper. Lát cắt sau đó được chuyển sang tấm màng lọc Omnipore membrane filter được đặt trong đĩa nhựa có hình dạng doughnut. Toàn bộ đĩa trên được đặt trong đĩa 6 giếng có chứa môi trường nuôi cấy phù hợp. Thành phần của môi trường nuôi cấy bao gồm 50 % Minimum essential medium, 25 % Hank’s balanced salt solutions, 23 % heat-inactivated horse serum, được bổ sung thêm 6,5 g/L glucose, 50 unit/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin sulfat, và 2 % B-27. Lát cắt được nuôi cấy trong tủ cấy được duy trì ở điều kiện 37 °C, 95 % không khí ẩm - 5 % CO2 trong khoảng thời gian 7 ngày trước khi sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Môi trường nuôi cấy được thay 2 lần/tuần.
2.3.3. Mô hình gây thiếu oxy và glucose (Oxygen and glucose deprivation - OGD) trên lát cắt hồi hải mã nuôi cấy (OHSCs) trên lát cắt hồi hải mã nuôi cấy (OHSCs)
OHSCs được đặt trong môi trường thiếu D-glucose và đã cân bằng với hỗn hợp khí 95 % N2 – 5 % CO2 trong thời gian 90 phút. Các lát cắt này sau đó được đặt trong một hộp kín được thổi bởi dòng khí 95 % N2 – 5 % CO2 trong khoảng thời gian 60 phút (hoặc thời gian khác tùy theo từng thí nghiệm). Sau khoảng thời gian này, lát cắt được đưa ra khỏi hộp và được đưa vào nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy thông thường trong thời gian 24 giờ trước khi đánh giá mức độ tổn thương tế bào trên OHSCs.
2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh trước những tổn thương gây bởi thiếu máu não cục bộ. gây bởi thiếu máu não cục bộ.
Các thuốc thử hoặc thuốc đối chứng dương MK-801 hydrogen maleat được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 24 giờ trước khi tiến hành OGD và ngay sau quá trình
24
OGD. Cao chiết của các thuốc thử và thuốc đối chứng dương MK-801 hydrogen maleat được hòa trong DMSO để tạo thành dung dịch gốc. Các dung dịch gốc này được bảo quản ở -20 °C đến khi sử dụng. Nồng độ của DMSO trong môi trường nuôi cấy tế bào được duy trì ở mức thấp hơn 0,05 % (v/v). Với nồng độ này, DMSO không ảnh hưởng đến khả năng sống của các tế bào thần kinh trên lát cắt thùy hải mã nuôi cấy.
Hình 2.2. Sơ đồ thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của các dược liệu sau khi gây mô hình OGD
2.3.5. Đánh giá mức độ tổn thương tế bào trên OHSCs
Mức độ tổn thương tế bào trên OHSCs được đánh giá bằng cách xác định mức độ hấp thụ propidium iodid (PI) của lát cắt sau 24 giờ xử lý OGD. PI được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 30 phút trước khi đánh giá những tổn thương trên OHSCs. Hình ảnh huỳnh quang của PI được chụp lại sử dụng kính hiển vi huỳnh quang. Sau đó cường độ sáng của tín hiệu PI được phân tích sử dụng phần mềm Image-J software (ver. 1.41, NIH; Bethesda, MD, USA). Giá trị thu được từ các lát cắt mô đã được xử lý với 100 μM N-Methyl D-aspartic acid (NMDA) được coi là 100 % tổn thương và sau đó được so sánh với các giá trị thu được từ các lát cắt mô đã được xử lý với các thuốc thử.
2.4. Xử lý số liệu
Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng SigmaPlot 12.0 (SYSTAT software Inc, Richmond, CA, USA). Kết quả được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM. Sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one - way ANOVA) sau đó sử dụng test hậu kiểm Student – Newman - Keuls để so sánh từng cặp. Sự khác biệt được coi có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Bảng 2.3. Chú thích ký hiệu giá trị p
p < 0,05 p < 0,01 p < 0,001
Khác biệt so với OHSCs sinh lý * ** ***
25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ
3.1. Triển khai mô hình gây thiếu máu não trên lát cắt thùy hồi hải mã nuôi cấy in
vitro
Hiện nay, trên thế giới các mô hình gây thiếu oxy và glucose (OGD) có thời gian tiến hành khác nhau tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu. Một nghiên cứu sử dụng lát cắt hồi hải mã để đánh giá tổn thương não, bảo vệ và sửa chữa thần kinh đã so sánh tương quan giữa thời gian tiến hành OGD với phần trăm hấp thụ PI của tế bào [33]. Thời gian tiến hành gây thiếu oxy và glucose là từ 0 – 125 phút, kết quả cho thấy: tại thời điểm 60 phút, mức độ hấp thụ PI gần như đạt cực đại và sau 75 phút thì mức độ hấp thụ PI gần như không tăng lên nữa. Tuy nhiên để xác định khoảng thời gian tối ưu, phù hợp với các thiết bị và điều kiện thực hành tại phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành gây mô hình thiếu oxy và glucose đối với tế bào hồi hải mã nuôi cấy trong các khoảng thời gian là 30 phút, 60 phút và 90 phút để đánh giá và lựa chọn thời gian phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu.
26
Hình 3.1. Đánh giá thời gian gây mô hình OGD tối ưu. (A) Sơ đồ thử nghiệm. (B) Hình ảnh đặc trưng lát cắt hồi hải mã. (C) Mức độ hấp thụ PI. *p < 0,05 so với OHSCs sinh lý, ***p < 0,001 so với OHSCs sinh lý
Kết quả hình trên chỉ ra rằng:
Thời gian OGD trong vòng 30, 60, 90 phút đều làm tăng có ý nghĩa thống kê % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý so với OHSCs sinh lý. Mức độ tổn thương tế bào thần kinh trên OHSCs phụ thuộc vào thời gian tiến hành OGD.
Tại thời điểm 30 phút, số lượng tế bào chết còn ít, nên sẽ không thể hiện rõ được tác dụng của thuốc nếu áp dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo. Tại thời điểm 90 phút, số lượng các tế bào thần kinh chết quá lớn (≈ 100 %) nên nếu dùng thuốc cũng không thể hồi phục được.
Do đó, 60 phút là thời gian tối ưu để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của dành dành, tam thất, ngưu tất, lá hồng trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro
Để đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của các loại dược liệu, tiến hành thêm thuốc thử vào môi trường nuôi cấy 24 giờ trước khi gây mô hình gây thiếu oxy và
27
glucose. Sau khi gây mô hình OGD trong thời gian 60 phút, thay môi trường OGD và tiếp tục ủ thuốc thêm 24 giờ.
3.2.1. Tác dụng của cao chiết cồn dành dành và geniposid trên mô hình OGD
3.2.1.1. Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết cồn dành dành
Hình 3.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của dành dành trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro. (A) Hình ảnh đặc trưng lát cắt hồi hải mã. (B) Mức độ hấp thụ PI. ***p < 0,001 so với OHSCs sinh lý, ###p < 0,001 so với OHSCs bệnh lý
Kết quả hình trên cho thấy:
% hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,001).
Sử dụng MK-801 liều 25 µM, % hấp thụ PI của OHSCs gây mô hình OGD giảm