Hình 3.6. Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của lá hồng trên mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro. (A) Hình ảnh đặc trưng lát cắt hồi hải mã (B) Mức độ hấp thụ PI. ***p < 0,001 so với OHSCs sinh lý, ###p < 0,001 so với OHSCs bệnh lý
Kết quả hình trên cho thấy:
% hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý tăng có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI ở OHSCs sinh lý (p < 0,001).
Sử dụng MK-801 liều 25µM, % hấp thụ PI của OHSCs gây mô hình OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001).
Sử dụng cao định chuẩn lá hồng ở nồng độ 5 µg/ml, 10 µg/ml và 30 µg/ml, % hấp thụ PI của OHSCs gây mô hình OGD giảm có ý nghĩa thống kê so với % hấp thụ PI của OHSCs bệnh lý (p < 0,001).
Kết quả này chứng tỏ cao định chuẩn lá hồng liều 5, 10 và 30 µg/ml có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh hồi hải mã trên mô hình OGD.
32
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Thời gian triển khai mô hình OGD tối ưu
Trong đột quỵ thiếu máu não cục bộ, lượng máu cung cấp cho não bị giảm đột ngột dẫn tới tình trạng thiếu oxy và glucose để nuôi dưỡng và duy trì hoạt động của tế bào não. Ngày càng nhiều các mô hình đột quỵ in vitro được tiến hành để có những hiểu biết rõ ràng hơn về cơ chế ở cấp độ phân tử và tế bào của các quá trình xảy ra trong thiếu máu não cục bộ ví dụ như mô hình gây thiếu oxy và glucose (OGD). Để bắt chước sự gián đoạn nguồn cung cấp oxy và chất dinh dưỡng xảy ra khi thiếu máu, các dòng tế bào, tế bào sơ cấp, lát cắt các cơ quan trong não và lát cắt não được ủ trong môi trường không có glucose và loại bỏ oxy. Có nhiều loại tế bào khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu in vitro, trong đó nuôi cấy các lát cắt kiểu cơ quan có nhiều ưu điểm hơn do bảo tồn được mối quan hệ chức năng và sự tương tác giữa các tế bào thần kinh lân cận như tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm [27].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nuôi cấy thành công lát cắt thùy hải mã sử dụng chuột nhắt non 6 - 7 ngày tuổi và triển khai mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro
sử dụng phương pháp loại bỏ oxy trên lát cắt thùy hải mã nuôi cấy. Nuôi cấy lát cắt hồi hải mã kiểu cơ quan (OHSCs) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu các bệnh về não do nó có các ưu điểm nổi bật hơn so với các mô hình in vivo và in vitro khác như: là mô hình tốt để sàng lọc tác dụng bảo vệ thần kinh của thuốc thử (chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ mẫu nghiên cứu), có thể đánh giá xem liệu rằng thuốc có tác dụng bảo vệ trực tiếp với tế bào thần kinh hay không do không có giai đoạn chuyển hóa qua gan. Ngoài ra, OHSCs bảo tồn cấu trúc không gian 3 chiều của mô, duy trì hoạt động của tế bào thần kinh và sự dẫn truyền qua synap; đồng thời cũng “bắt chước” hoàn hảo các điều kiện của mô hình in vivo. Hơn nữa, phương pháp tiến hành đơn giản hơn mô hình in vivo và có thể được điều khiển bởi tăng hoặc giảm hoạt động của các gen. Nuôi cấy hồi hải mã trong thời gian dài có thể minh họa cho sự phát triển của não bao gồm các mô hình điều hòa gen, biểu hiện protein và các hoạt động thần kinh của hồi hải mã phụ thuộc tuổi. Do đó, OHSCs được sử dụng ngày càng nhiều trong nghiên cứu các bệnh thoái hóa thần kinh, chấn thương sọ não, đột quỵ cũng như sàng lọc thuốc để phát hiện các phương pháp điều trị mới [28].
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chuột nhắt non 7 ngày tuổi chủng Swiss albino để chuẩn bị lắt cắt thùy hải mã. Mô não sử dụng trong mô hình thường được lấy
33
từ chuột sơ sinh 6 - 7 ngày tuổi do trong giai đoạn này, mô não có tính mềm dẻo cao và có khả năng chống chịu các tổn thương cơ học xảy ra trong quá trình chuẩn bị lát cắt để nuôi cấy. Nếu lấy chuột quá nhỏ, mô não sẽ bị mất các đặc điểm hình thái khi nuôi cấy; trong khi não ở những con chuột lớn hơn 7 ngày và chuột trưởng thành thường đã trải qua quá trình thoái hóa thần kinh nên không phù hợp trong nghiên cứu [28], [32]. Thời gian nuôi cấy các lát cắt tế bào hồi hải mã sẽ là 7 ngày do thời điểm 7 ngày là thời kỳ cuối pha log, số lượng tế bào sinh trưởng đạt tối đa [56].
Về thời gian tối ưu để triển khai mô hình OGD kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: sau 30, 60, và 90 phút, số lượng tế bào thần kinh bị tổn thương ở hồi hải mã lần lượt là 39 %, 59 % và 87 %. Do đó nếu gây mô hình trong 30 phút, số lượng tế bào chết không đáng kể nên không chứng minh được hiệu quả của thuốc, trong khi tại thời điểm 90 phút số lượng tế bào thần kinh chết rất lớn nên dùng thuốc cũng không thể hồi phục được. Kết quả này cũng tương đồng với một nghiên cứu đánh giá tương quan giữa thời gian gây mô hình OGD và % hấp thụ PI sử dụng lát cắt hồi hải mã để nghiên cứu tổn thương não, bảo vệ và sửa chữa tế bào thần kinh. Kết quả cho thấy, các tế bào ở các khu vực khác nhau của hồi hải mã bắt đầu chết sau khi gây mô hình khoảng 25 phút. Thời gian gây ra 50 % mức độ hấp thụ PI cực đại ở vùng CA1 và CA3 lần lượt là 33 phút và 41 phút; sau 75 phút, % hấp thụ PI gần như không tăng lên nữa [33]. Do đó, lựa chọn thời gian gây mô hình OGD cho các nghiên cứu tiếp theo là 60 phút.
Sử dụng thuốc nhuộm PI là một phương pháp đơn giản, rẻ tiền và phổ biến trong đánh giá số lượng tế bào chết. Propidium iodid (PI) là thuốc nhuộm huỳnh quang ổn định, có kích thước nhỏ, bị kích thích ở bước sóng 400 – 600 nm và phát ra ánh sáng ở bước sóng 600 – 700 nm. Là một phân tử phân cực, PI chỉ đi qua được màng của tế bào chết hoặc tổn thương. Nó tương tác với ADN của tế bào và phát ra ánh sáng đỏ dưới kính hiển vi điện tử. PI không độc với tế bào thần kinh, được xem như chất chỉ điểm cho tổn thương và mất tính toàn vẹn của màng tế bào. Ưu điểm của phương pháp sử dụng thuốc nhuộm PI để đánh giá số lượng tế bào chết là cách thực hiện đơn giản, giải quyết được một lượng mẫu lớn do đó đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Tuy nhiên, nhược điểm của nó là không phân biệt được các loại tế bào chết khác nhau; trong trường hợp này nếu muốn phát hiện tế bào chết thep chương trình (apoptosis) cần phải sử dụng kết hợp Propidium iodid với các nhuộm khác như Annexin V [13], [14], [32].
34
4.2. Tác dụng bảo vệ thần kinh của một số dược liệu
Trong thiếu máu cục bộ não, các phương pháp điều trị được chia thành 2 nhóm chính là: tái tưới máu và bảo vệ thần kinh. Trong khi mục đích của thuốc tiêu huyết khối và các dụng cụ hỗ trợ là khôi phục dòng máu thì các chất bảo vệ thần kinh được sử dụng nhằm mục đích bảo vệ vùng penumbra (vùng tranh tối tranh sáng) để ngăn ngừa các tổn thương tiến triển trong vùng lõi thiếu máu [17]. Cơ chế của các chất bảo vệ thần kinh hiện nay chủ yếu nhắm vào các đích trong cơ chế bệnh sinh của thiếu máu cục bộ não như ổn định dòng canxi nội bào, chống độc tố kích thích, chống oxy hóa, chống viêm,... Các chất này tuy cho thấy nhiều lợi ích trên các mô hình thí nghiệm nhưng lại không thể hiện được hiệu quả điều trị trên lâm sàng. Lấy ví dụ một chất điển hình là MK-801 – thuốc chứng dương trong nghiên cứu này: MK-801 là chất đối kháng thụ thể NMDA nên ngăn sự tích tụ glutamat ngoại bào, do đó trên mô hình thiếu máu não cục bộ, nó cho thấy những lợi ích rõ ràng là giảm tới 75 % thể tích nhồi máu. Tuy nhiên, trên lâm sàng các thử nghiệm đều phải kết thúc sớm do tác dụng phụ nghiêm trọng gây rối loạn tâm thần [42].
Bên cạnh các thuốc hóa dược thì các bài thuốc cổ truyền và thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đang ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học do không chỉ chống lại các tác nhân gây tổn thương trong thiếu máu não cục bộ mà còn có tác dụng dự phòng, điều trị phục hồi tổn thương sau thiếu máu và an toàn hơn các thuốc hóa dược khi sử dụng lâu dài [19]. Đây cũng là cơ sở để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này.
4.2.1. Dành dành và geniposid
Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) là một trong những vị thuốc xuất hiện sớm nhất trong Dược điển Trung Quốc với các công dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, lương huyết,... Các iridoid glycosid là thành phần có hoạt tính sinh học chính, được sử dụng trong điều trị các tổn thương do thiếu máu não cục bộ nhờ vào khả năng chống oxy hóa và ngăn sự chết của tế bào thần kinh theo chương trình [50]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sử dụng cao chiết cồn dành dành liều 10, 30 µg/ml và geniposid liều 5, 25 µM có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trên lát cắt thùy hồi hải mã nuôi cấy đối với những tổn thương gây ra bởi thiếu oxy và glucose. Một nghiên cứu khác tại Viện Dược liệu cũng cho thấy rằng cao chiết quả dành dành có tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh trên chuột đột quỵ não do tắc động mạch não giữa ở liều 500 – 1000 mg/kg TT
35
[46]. Bài thuốc Tongluojiunao với sự kết hợp của quả dành dành và rễ tam thất (2 thành phần tạo nên hoạt tính chính là geniposid của dành dành và ginsenosid Rg1 của tam thất) cho thấy các tác dụng đáng mong đợi ở bệnh nhân suy giảm nhận thức, thiếu máu não cục bộ và làm chậm thoái hóa thần kinh như hội chứng Alzheimer. Thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của Tongluojiunao nồng độ 5 mg/ml (tương đương với 1,25 µM ginsenosid Rg1 và 12,36 µM geniposid) trên mô hình OGD cho thấy: Tongluojiunao làm giảm sự chết của các tế bào hồi hải mã, bảo vệ các tế bào nội mạc mạch máu não khỏi những tổn thương do OGD và tăng khả năng sống sót của các tế bào thần kinh hải mã [8]. Một nghiên cứu in vitro khác cũng cho thấy sử dụng geniposid nồng độ 12,5, 25 và 50 µg/ml có tác dụng làm giảm số lượng tế bào thần kinh hồi hải mã chết do tình trạng thiếu oxy và glucose gây ra. Như vậy, geniposid là một chất tiềm năng trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh do có nhiều tác dụng dược lý: bảo vệ thần kinh, chống viêm, chống tăng sinh và chống oxy hóa. Nó tăng cường sự chuyển vị của Nrf2 đến nhân tế bào, dẫn đến tăng cường biểu hiện của các gen chống oxy hóa; làm giảm đáp ứng viêm qua trung gian tế bào thần kinh đệm do giảm sản xuất các cytokin tiền viêm. Ngoài ra, nó cũng làm giảm mức độ của cơ chế tự thực bào của tế bào thần kinh và bảo tồn các chức năng của não trong thiếu máu não cục bộ cấp tính [50], [52].
Tóm lại, nghiên cứu này đã cung cấp thêm bằng chứng về tác dụng bảo vệ thần kinh của cao dành dành nói chung và geniposid nói riêng đối với những tổn thương do tình trạng thiếu oxy và glucose gây ra. Đồng thời, kết quả này cũng đã góp phần chứng minh rằng có thể sử dụng mô hình OGD trên lát cắt thùy hải mã nuôi cấy để sàng lọc các cao chiết dược liệu có tác dụng bảo vệ trước những tổn thương thần kinh do thiếu máu não cục bộ.
4.2.2. Tam thất
Tam thất (Panax notoginseng) từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong phòng ngừa và điều trị thiếu máu não cục bộ. Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh cao chiết cồn từ rễ củ tam thất liều 30 µg/ml có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với các tế bào hồi hải mã nuôi cấy do làm giảm đáng kể số lượng tế bào chết khi thiếu oxy và glucose. Trong nghiên cứu trước đây tại Viện Dược liệu trên dạng cao chiết này cao tam thất liều 150 mg/kg TT có tác dụng bảo vệ thần kinh trên mô hình chuột nhắt gây tắc động mạch não giữa (MCAO) thông qua các tiêu chí: giảm mức độ nhồi máu não, cải thiện chức năng vận động và trí nhớ không gian [45]. Nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro khác cũng
36
được thực hiện nhằm làm sáng tỏ tác dụng bảo vệ thần kinh của tam thất như: đánh giá tác dụng của saponin toàn phần, ginsenosid Rb1, Rg1 trên mô hình gây tắc động mạch não giữa; tác dụng của ginsenosid Rb1, Rd, Rg1, notoginsenosid R1 trên mô hình gây thiếu oxy và glucose ở nhiều loại tế bào khác nhau. Cơ chế bảo vệ thần kinh của ginsenosid Rb1, Rd và Rg1 được cho là điều hòa xuống sự hoạt hóa tế bào thần kinh đệm thông qua ức chế yếu tố chuyển vị nhân NF-κB. Ngoài ra, các gốc oxy tự do ROS tạo ra trong stress oxy hóa sẽ phản ứng và oxy hóa hầu hết các phân tử sinh học như carbohydrat, lipid, protein, và ADN, là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến tổn thương tế bào não trong thiếu máu cục bộ. Saponin toàn phần trong tam thất, ginsenosid Rg1, Rb1 thể hiện tác dụng chống oxy hóa qua hai con đường chính: thứ nhất là ức chế trực tiếp sự sản xuất các gốc tự do thông qua ức chế myeloperoxidase (MPO) và NADPH oxidase (NOX) – 2 enzym chịu trách nhiệm sản xuất các gốc tự do này, đồng thời làm giảm tích lũy của các sản phẩm peroxy hóa như malondialdehyd-MDA; thứ hai, làm tăng cường biểu hiện của các phân tử và enzym chống oxy hóa như superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT), thioredoxin-1 (Trx-1), protein kinase B (PKB) và Nrf2, do đó tăng khả năng chống chịu trước những tổn thương oxy hóa in vivo và in vitro [47].
Như vậy, nghiên cứu này đã cung cấp thêm bằng chứng về tác dụng bảo vệ thần kinh của cao tam thất đối với những tổn thương do thiếu máu não cục bộ gây ra. Đồng thời, kết quả này cũng đã góp phần chứng minh rằng có thể sử dụng mô hình OGD trên lát cắt thùy hải mã nuôi cấy để sàng lọc các cao chiết dược liệu có tác dụng bảo vệ trước những tổn thương thần kinh do thiếu máu não cục bộ.
4.2.3. Ngưu tất
Ngưu tất (Achyranthes bidentata) là loài thảo mộc được sử dụng lâu năm ở Trung Quốc nhờ vào đặc tính thúc đẩy lưu thông máu. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh của cao định chuẩn ngưu tất có hàm lượng saponin tổng đạt 40,24 %. Kết quả cho thấy cao định chuẩn ngưu tất không có tác dụng bảo vệ thần kinh trên mô hình đột quỵ não in vitro. Nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro hiện nay được thực hiện trên các polypeptid từ ngưu tất đã cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh mạnh thông qua chống lại chết tế bào theo chương trình. Hơn nữa, các polypeptid phân lập từ dịch chiết rễ ngưu tất cũng cho thấy khả năng tăng cường hồi phục chức năng vận động, cảm giác, nhận thức ở những con chuột sau đột quỵ thiếu máu cục bộ khi gây mô hình tắc động mạch não giữa [37], [48]. Ngoài ra, mô hình thiếu máu não cục bộ in vitro
37
cũng chứng minh rằng các polypeptid của ngưu tất có tác dụng chống chết tế bào theo chương trình do ức chế dòng glutamat gây độc với tế bào thần kinh ở hồi hải mã. Trong mô hình này, các tế bào thần kinh hồi hải mã được ủ trong môi trường chứa polypeptid phân lập từ rễ ngưu tất trước khi bị tổn thương bởi các độc tính kích thích do glutamat.