2.3.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu đánh giá tác dụng sinh học
Lá cây Đinh lăng răng (4,1 kg) được cắt nhỏ, ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ 65oC (8 lít x 3 lần). Lọc, gộp dịch lọc, và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết cồn (1128,54 g). Hiệu suất chiết cao chiết cồn là 27 %. Cao chiết cồn được hòa tan vào nước cất (1 lít), sau đó chiết lần lượt với dung môi n-hexan (1 lít × 3 lần), EtOAc (1 lít × 3 lần), và n-butanol (1 lít × 3 lần). Thu được các phân đoạn phân đoạn n-hexan (282,66 g), EtOAc (126,07 g) và n-butanol (150,54 g). Tiến hành thu hồi dung môi theo từng phân đoạn.
18
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Ký hiệu mẫu:
- LH: Cao chiết phân đoạn n-hexan. - LB: Cao chiết phân đoạn n-butanol. - LE: Cao chiết phân đoạn ethyl acetat. - CTC: Cao chiết toàn phần.
- LB 1.1: acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic. - LB 2: quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid.
2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Dựa trên việc phân tích ưu nhược điểm của các mô hình thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hóa học (thực nghiệm đơn giản, cho kết quả có độ chính xác cao và áp dụng được cho nhiều đối tượng nghiên cứu), mô hình đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH được sử dụng trong khoá luận.
Nguyên tắc: Khi pha DPPH vào EtOH thu được một dung dịch có màu tím đặc trưng, độ đậm nhạt của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ của gốc DPPH. Khi có chất chống oxy hóa trong dung dịch, chất chống oxy hóa sẽ cho DPPH một hydro tạo thành các dẫn
Dược liệu( 4,1kg)
- Chiết với ethanol 96% tại 65oC (8 lít x 3 lần) , 4 giờ/ lần - Thu hồi dung môi
Cắn chiết ethanol (1128,54 g)
- Phân tán trong nước
- Lắc với n-hexan ( 1 lít x 3 lần) - Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước
- Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước
- Lắc với n-butanol ( 1 lít x 3 lần)
Phân đoạn n- butanol (150,54 g)
Phân đoạn nước Phân đoạn
n-hexan (282,66 g)
Phân đoạn ethyl acetat
(126,07 g)
- Thu hồi dung môi
19
xuất của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin không phải gốc tự do. Các dẫn xuất này có màu vàng, do đó màu tím đặc trưng của DPPH sẽ giảm dần, chuyển dần thành màu vàng của sản phẩm tạo ra. Khi đó, lượng gốc DPPH giảm đi chính là lượng gốc tự do đã bị “bắt”, nên tác dụng bắt gốc tự do DPPH của một chất thử sẽ tỷ lệ thuận với mức độ đổi màu của dung dịch. Do đó, ta có thể đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 515nm để xác định mức độ chống oxy hóa của chất thử.
Diphenylpicrylhydrazyl ( Gốc tự do )
Diphenylpicrylhydrazin
Hình 2.4Cơ chế dọn gốc tự do DPPH
Tiến hành:
- Pha DPPH trong ethanol 96% để được dung dịch có nồng độ 300 µM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các mẫu thử pha trong DMSO để được các dung dịch gốc có nồng độ 8 g/ml với các mẫu dịch chiết thô; 2 g/ml với các mẫu chất tinh sạch.
- Trên mỗi giếng thử của phiến 96 giếng, trộn 10 µL dung dịch mẫu thử trong DMSO 100% với 190 µL dung dịch DPPH/EtOH. Sau đó, tiếp tục pha loãng 3 lần, dải nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu: 50-100-200- 400 µg/mL đối với mẫu cao chiết toàn phần và các phân đoạn; 12,5-25-50-100 µg/mL đối với các mẫu chất tinh khiết.
- Phiến thí nghiệm được bọc kín tránh ánh sáng, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút để phản ứng oxy hóa diễn ra hoàn toàn.
- Sau phản ứng tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm với máy đo quang Tecan (Tecan F150, Austria).
- Đối chứng âm là giếng thử chứa 10 µL DMSO thay cho mẫu thử.
- Đối chứng dương là acid ascorbic (Sigma-Aldicrich, USA) (nồng độ 12,5-100 µg/mL).
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên cùng phiến thử, giá trị độ hấp thụ để tính kết quả là giá trị trung bình của 3 giếng thử.
20
Tính toán kết quả:
Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình của 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn. Giá trị trung bình của SC (%) ( là tỉ lệ bắt gốc tự do của mẫu nghiên cứu ) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Excel theo công thức:
SC% = [100 −OD (mẫu thử) − OD (mẫu trắng)
OD (chứng âm tính) × 100] ± σ
Độ lệch chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau:σ = √(∑(xi− x̅)2 )/(n − 1) Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Giá trị IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, được xác định bằng phần mềm Excel qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.
Thông số đánh giá: Tác dụng bắt gốc tự do DPPH được đánh giá qua giá trị IC50. Giá trị IC50 càng nhỏ thì mẫu có hoạt tính càng cao.
2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.
Nguyên tắc: Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Tiến hành:
- Tế bào ung thư được trypsin hóa, đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ trước khi hòa với dung dịch chứa mẫu thử.
- Thêm vào các giếng thử nghiệm với lượng tế bào phù hợp ( 5*103 tế bào một giếng).
- Chất thử được pha loãng bằng DMSO và đưa vào đĩa 96 giếng. Nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu: 5-10-20-40 µg/mL đối với mẫu cao phân đoạn, 1-2,5-5-10 µg/mL đối với các mẫu chất tinh khiết. Ủ trong tủ ấm nhiệt
21
độ 37oC chứa 5% CO2 trong 72 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư sẽ được sử dụng như đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau giai đoạn ủ trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định bằng TCA trong 30 phút, sau đó được nhuộm bằng SRB trong vòng 1 giờ ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acid acetic 5% rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM Tris base để hòa tan lượng SRB, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515nm.
- Phép thử được lặp lại 3 lần để tăng độ chính xác. Elipticine được sử dụng như là đối chứng dương. DMSO 10% được sử dụng như là đối chứng âm.
Tính toán kết quả:
Kết quả OD được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 515nm.
Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng.
Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CS% = OD (mẫu) − OD (ngày O)
OD (DMSO) − OD (ngày O)× 100
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau:
Độ lệch tiêu chuẩn σ
σ = √(∑(xi − x̅)2 ) /(n − 1)
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50 . Giá trị IC50 (50% Inhibitory Concentration) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế được 50% số lượng tế bào nghiên cứu.
Cách tính giá trị IC50:
Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gíá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX
22
(Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%))
Thông số đánh giá: Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 < 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
2.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành bằng phương pháp pha loãng trên đĩa 96 giếng.
Nguyên tắc:
Trong quá trình thử nghiệm, các giếng được bổ sung môi trường thử nghiệm. Sau đó, các nồng độ khác nhau của mẫu thử và vi khuẩn được kiểm tra được thêm vào giếng. Giếng được đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp. Sau thời gian quy định, giếng được lấy ra và kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn. Nếu môi trường trở nên đục hoặc một lớp tế bào được hình thành ở đáy thì sự phát triển của vi khuẩn đã xảy ra. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), là nồng độ thấp nhất đã ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.
Tiến hành
- Các chủng vi sinh vật được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108 vi sinh vật/ml) rồi tiến hành thí nghiệm.
- Các mẫu thử pha trong DMSO để được các dung dịch gốc có nồng độ 8 g/ml với mẫu cao chiết toàn phần và các phân đoạn; 2 g/ml với các mẫu chất tinh khiết. - Trên mỗi giếng thử của phiến 96 giếng, trộn 10 µL dung dịch mẫu thử trong
DMSO 100% với 190 µL dung dịch vi sinh vật đã hoạt hóa. Sau đó, tiếp tục pha loãng 3 lần, dải nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu: 400; 200; 100; 50 μg/ml đối với mẫu cao chiết toàn phần và các phân đoạn, 100; 50; 12,5; 6,25 µg/mL đối với các mẫu chất tinh khiết.
- Đối chứng dương: Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Streptomycin 0,1 mM, tetracylin: 0,1 mM, nystatin: 0,1mM.
- Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật thử nghiệm.
23
Đánh giá kết quả: Kết quả được xác định dựa trên sự hình thành sinh khối của VSV trong mỗi giếng thử, được xác định sau khi pha loãng và đo mật độ quang cho các vi khuẩn và nấm men, hoặc được quan sát bằng mắt thường đối với nấm sợi. Mật độ quang càng cao thì có nghĩa là sinh khối VSV càng nhiều, mẫu nào có hoạt tính kháng vi sinh vật thì sẽ làm mật độ quang giảm so với đối chứng. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (ug/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà VSV bị ức chế (khi nuôi cấy lại không có sự hình thành khuẩn lạc).
Thông số đánh giá: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ tối thiểu của kháng sinh có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn ở mức có thể quan sát được.
2.4. Nơi thực hiện đề tài
- Quá trình chuẩn bị mẫu thử nghiệm hoạt tính sinh học được thực hiện ở bộ môn Dược học cổ truyền.
- Quá trình đánh giá các hoạt tính sinh học được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hoá học các hợp chất hữu cơ, viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam
24
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Sáu mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, phân đoạn hexan của lá (LH), phân đoạn n- butanol của lá (LB), phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính chống oxy hoá theo phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH được mô tả trong mục 2.3.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả hoạt tính chống oxy hoá của các phân đoạn và các chất tinh khiết được trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hoá
TT Kí hiệu mẫu Nồng độ đầu của mẫu (g/ml) Scavenging capacity (SC, %) Đối chứng (+) 50 82,230,75 Đối chứng (-) - 0 1 Cao chiết tổng cồn 400 18,551,64 2 LH 400 13,520,48 3 LB 400 52,611,06 4 LE 400 18,860,16 5 VB 400 46,180,62 6 LB2 100 74,011,11 7 LB1.1 100 1,940,53
Như vậy, 2 mẫu LB và LB 2 có SC > 50 %. Hai mẫu này được tiếp tục tìm giá trị IC50 bằng phần mềm Excel
25
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ (µg/ml) và SC(%) của chất LB 2
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ (µg/ml) và SC(%) của LB
Bảng 3.2 Kết quả dọn gốc DPPH của mẫu LB 2 Nồng độ mẫu
(µg/ml) 100 50 25 12,5 IC50
SC 𝜎 (%) 74,011,11 51,711,21 39,560,75 34,990,52 46,15 (µg/ml)
Bảng 3.3 Kết quả dọn gốc DPPH của mẫu LB Nồng độ mẫu
(µg/ml) 400 200 100 50 IC50
SC 𝜎 (%) 52,161,06 32,540,94 22,544,61 17,720,73 373,92 (µg/ml)
Nhận xét:
Mẫu thử LB và LB 2 biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH với giá trị IC50 lần lượt là 373,92 và 46,15 µg/ml;
Với 2 mẫu LB, LB2 nhận thấy khả năng bắt gốc tự do tỷ lệ thuận với nồng độ mẫu thử;
So sánh với mẫu chứng dương là acid ascorbic có giá trị IC50 13,88 µg/ml, nhận thấy cao chiết phân đoạn n-butanol của lá trung hoà gốc tự do DPPH kém hơn 26,94 lần và chất tinh khiết quercetin-3,7-O-α-L- dirhamnopyranosid kém hơn 3,32 lần;
26
Các mẫu thử còn lại không biểu hiện hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH tại nồng độ thử nghiệm.
27
3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Năm mẫu thử bao gồm cao phân đoạn hexan của lá (LH), phân đoạn n-butanol của lá (LB), phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp Monks được mô tả ở mục 2.3.2.
Các dòng tế bào thử hoạt tính:
- Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan). - Dòng A549 (Human lung carcinoma – Ung thư phổi).
- Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ).
Bảng 3.4 Giá trị CS trong đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
TT KH mẫu Nồng độ đầu (μg/ml) Giá trị CS (%) Dòng tế bào
Hep-G2 A549 Vero
DMSO - 100 100 Đối chứng (+) 5 0,93±0,50 2,91±1,31 20,66±1,54 1 LH 40 97,77±0,24 99,27±0,80 97,32±0,31 2 LB 40 98,24±0,53 99,48±0,38 98,66±0,35 3 LE 40 99,33±0,08 98,32±1,49 96,71±0,97 4 LB2 10 97,72±0,73 98,86±0,46 98,11±1,16 5 LB1.1 10 98,22±0,82 99,53±0,57 99,12±0,70
Các mẫu đều có CS > 50%, do đó không được tiếp tục thử nghiệm để tìm giá trị IC50 . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét: Các mẫu không biểu hiện hoạt tính ức chế ba dòng tế bào ung thư (Hep-G2 và A549) và dòng tế bào Vero tại nồng độ thử nghiệm.
3.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Sáu mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, phân đoạn hexan của lá (LH), phân đoạn
n-butanol của lá (LB), phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm theo phương pháp pha loãng trên đĩa 96 giếng được mô tả trong mục 2.3.3.
Các chủng vi sinh vật kiểm định
28
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)
- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis subsp. spizizenii (ATCC 6633)
Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 25923)
- Nấm sợi: Aspergillus niger (ATCC 6275)
Fusarium oxysporum (ATCC 7601)
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 10231)
Saccharomyces cerevisiae (VTCC–Y–62) Chứng dương:
- Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+)
- Tetracyclin cho vi khuẩn Gr (-)
- Nystatin cho nấm sợi và nấm men.
Chứng âm: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.
Kết quả hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các phân đoạn và các chất tinh khiết được trình bày ở bảng 3.5.
29
Bảng 3.5Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Mẫu thử Nồng độ đầu của mẫu (g/ ml)
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml) Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men E. coli P. aerugi nosa B. subtill is S. aureus A. niger F. oxysporum S. cerevi siae C. albicans