Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm- 123docz.net

Sáu mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, phân đoạn hexan của lá (LH), phân đoạn

n-butanol của lá (LB), phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm theo phương pháp pha loãng trên đĩa 96 giếng được mô tả trong mục 2.3.3.

Các chủng vi sinh vật kiểm định

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis subsp. spizizenii (ATCC 6633)

Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 25923)

- Nấm sợi: Aspergillus niger (ATCC 6275)

Fusarium oxysporum (ATCC 7601)

- Nấm men: Candida albicans (ATCC 10231)

Saccharomyces cerevisiae (VTCC–Y–62) Chứng dương:

- Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+)

- Tetracyclin cho vi khuẩn Gr (-)

- Nystatin cho nấm sợi và nấm men.

Chứng âm: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các phân đoạn và các chất tinh khiết được trình bày ở bảng 3.5.

Bảng 3.5Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Mẫu thử Nồng độ đầu của mẫu (g/ ml)

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml) Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men E. coli P. aerugi nosa B. subtill is S. aureus A. niger F. oxysporum S. cerevi siae C. albicans Tetracyclin 44 ( 0,1 mM) 5,5 11 Streptomycin 57,5 ( 0,1 mM) 7,188 14,375 Nystatin 92,5 ( 0,1 mM) 23,125 11,563 5,7851 11,563 DMSO - - - - - CTC 400 (-) (-) 400 (-) (-) (-) (-) (-) LH 400 (-) (-) 400 (-) (-) (-) (-) (-) LB 400 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 200 (-) LE 400 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) LB2 100 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) LB1.1 100 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 12,5 50

Các mẫu không thể hiện sự ức chế vi khuẩn hoặc nấm được kí hiệu là (-).

Nhận xét:

- Mẫu LB 1.1 ức chế chủng S. cerevisiae với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 12,5 µg/ml. So với chứng dương Nystatin, MIC của LB 1.1 kém 2,1 lần.

- Mẫu LB 1.1 ức chế chủng C. albicans với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 50 µg/ml. So với chứng dương Nystatin, MIC của LB 1.1 kém 4,2 lần.

- Các mẫu Cao toàn phần,LH ức chế B.subtillis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 400 µg/ml. So sánh với chứng dương Streptomycin, MIC của CTC,LH kém 55,6 lần - Mẫu LB ức chế chủng S. cerevisiae với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 200 µg/ml. So với chứng dương Nystatin, MIC của LB kém 33,6 lần.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Hoạt tính chống oxy hoá

Trong khuôn khổ nghiên cứu này, hoạt tính chống oxy hoá được thử nghiệm trên sáu mẫu: cao toàn phần, cao chiết phân đoạn hexan của lá (LH), cao chiết phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), cao chiết phân đoạn n-butanol của lá (LB), các chất tinh khiết LB 1.1, LB 2 của lá Đinh lăng răng theo thử nghiệm DPPH. Các mẫu thử có khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%) > 50% sẽ được tiếp tục tìm giá trị IC50 (nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do).

Kết quả thử nghiệm cho thấy: cao chiết phân đoạn n-butanol của lá (LB) và chất tinh khiết quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid (LB2) biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH khá tốt với giá trị IC50 lần lượt là 373,92 và 46,15 µg/ml. So sánh với mẫu chứng dương là acid ascorbic có giá trị IC50 13,88 µg/ml, nhận thấy cao chiết phân đoạn n-butanol của lá trung hoà gốc tự do DPPH kém hơn 26,94 lần và chất tinh khiết

quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid kém hơn 3,32 lần. Các mẫu còn lại không thể hiện hoạt tính chống oxy hoá tại nồng độ thử nghiệm. Từ kết quả trên, nhận thấy:

- Cao chiết phân đoạn n-butanol của lá có hoạt tính chống oxy hoá giúp chứng minh phân đoạn này có các hợp chất có hoạt tính chống oxy hoá.

- Chất quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid có khả năng trung hoà gốc tự do DPPH tốt với giá trị IC50 là 46,15 µg/ml. Lý giải về khả năng trung hoà gốc tự do DPPH tốt với giá trị IC50 là 46,15 µg/ml của quercetin-3,7-O-α-L- dirhamnopyranosid, có thể dựa lý thuyết về liên quan cấu trúc và tác dụng: LB 2 là một flavonoid [6]. Tiềm năng thu dọn gốc tự do của flavonoid phụ thuộc vào dạng (cả số lượng và vị trí) của các nhóm −OH tự do trên khung flavonoid [17]. Flavonoid có nhiều nhóm hydroxyl là chất chống oxy hóa hiệu quả hơn những loại chỉ có một nhóm. Sự hiện diện của cấu trúc ortho ‐ 3,4 ‐ dihydroxy làm tăng hoạt tính chống oxy hóa [36]. Do đó, cấu trúc của hợp chất quercetin-3,7-O-α- L-dirhamnopyranosid là phù hợp với hoạt tính chống oxy hoá đã được đánh giá trong khoá luận.

Nghiên cứu cũng thúc đẩy việc tiếp tục tìm hiểu về cơ chế chống oxy hoá của các hợp chất tự nhiên:

Dưới tác động của ánh sáng, nhiệt độ hoặc xúc tác, phân tử hữu cơ được hoạt hoá, tạo thành gốc tự do. Sau đó, các gốc tự do phản ứng với oxy theo phản ứng dây chuyền. Chuỗi phản ứng dây chuyền này được gọi là quá trình oxy hoá [19]:

R : H + O :: O + Bộ khởi xướng → R • + HOO • R • + O :: O → ROO • ROO • + R: H → ROOH + R • RO : OH → RO • + HO • R :: R + • OH → R: R ‐ O • R • + R • → R: R R • + ROO • → ROOR

ROO • + ROO • → ROOR + O 2

ROO • + AH → ROOH + A • ROO • + A • → ROOA.

Các chất chống oxy hóa tác động vào quá trình trên theo 3 cơ chế: (1) ức chế sự hình thành gốc tự do bằng cách ức chế các enzym hoặc chelat hóa các kim loại chuyển tiếp liên quan đến quá trình tạo gốc tự do; (2) bắt gốc tự do; và (3) điều chỉnh hoặc bảo vệ khả năng chống oxy hóa [25] [49]. Kết quả trên đã khẳng định được chất quercetin-3,7- O-α-L-dirhamnopyranosid hoạt động theo cơ chế (2), cụ thể quercetin-3,7-O-α-L- dirhamnopyranosid có khả năng nhường hydro cho các gốc tự do, giúp trung hoà các gốc tự do. Ngoài ra, đã có nghiên cứu chỉ ra rằng: flavonoid có thể làm giảm sự tăng cường quá trình oxy hóa của kim loại chuyển tiếp bằng cách nhường H • cho chúng [35]. Tuy nhiên, trong phạm vi thực nghiệm của khoá luận, chưa thể chứng minh được cơ chế trên.

4.2. Hoạt tính gây độc tế bào

Khoá luận thực hiện đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu cao chiết phân đoạn hexan của lá (LH), cao chiết phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), cao chiết phân đoạn n-butanol của lá (LB), các chất tinh khiết LB 1.1, LB 2; trên 3 dòng tế bào là dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan), dòng A549 (Human lung carcinoma – Ung thư phổi), dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ). Đây là những dòng tế bào được sử dụng phổ biến trong đánh giá bước đầu về hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên. Kết quả cho thấy, tại nồng độ thử nghiệm, tất cả các mẫu không biểu hiện hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư (Hep-G2 và A549) và dòng tế bào Vero.

Các nghiên cứu trước đây về hoạt tính gây độc tế bào của chi Polyscias nói chung và loài Polyscias guilfoylei nói riêng đã ghi nhận các kết quả:

- Hoạt tính gây độc tế bào của saponin triterpenoidal đã được báo cáo[63].

- Hai axit oleanolic saponin Polyfodiolides A và Polyfodiolides B được phân lập từ dịch chiết ethanol của P. amplifolia cho thấy độc tính tế bào yếu đối với dòng tế bào ung thư buồng trứng ở người [30].

- Cao chiết P. fulva và thành phần chính α-hedrin của nó đều cho thấy hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm các kiểu hình kháng thuốc [44].

- Năm 2008, tác giả Giuseppina Cioffi đánh giá tác dụng chống tế bào ung thư ở người: J774.A1, HEK-293, và WEHI-164. Kết quả cho thấy hợp chất 3–β–O– [β–D–glucopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosyl]–echinocysticacid–28– [O–β–D–glucopyranosyl–(1→6)–O–β–D–glucopyranosyl] ester ức chế cả ba dòng tế bào ung thư trên [31].

- Năm 2018, Ashmawy và cộng sự đã công bố kết quả tinh dầu lá Polyscias guilfoylei cho thấy hoạt tính gây độc dòng tế bào Caco-2. [52]

- Năm 2019, Rajani và cộng sự đã công bố kết quả hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu lá Polyscias guilfoylei trên cả hai mô hình in vivo và in vitro đối với tế bào ung thư hạch bạch huyết [45].

So sánh kết quả của khoá luận với các nghiên cứu trên, nhận thấy:

- Các dòng tế bào Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) và A549 (Human lung carcinoma – Ung thư phổi) chưa được thử nghiệm với các phân đoạn

và các chất phân lập được từ loài Polyscias guilfoylei và chi Polyscias, vì vậy, nghiên cứu mong muốn sàng lọc hoạt tính trên hai dòng tế bào này để bổ sung cơ sở dữ liệu hoạt tính gây độc tế bào cho chi Polyscias. Tuy nhiên, việc không ghi nhận biểu hiện hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư (Hep-G2 và A549) và dòng tế bào Vero tại nồng độ thử nghiệm của các phân đoạn và các chất phân lập được từ

Polyscias guilfoylei đã sơ bộ sàng lọc được chi Polyscias nói chung và loài Polyscias guilfoylei nói riêng không có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư gan và ung thư phổi tại nồng độ thử nghiệm.

- Nghiên cứu của Ashmawy và cộng sự (2018) và nghiên cứu của Rajani và cộng sự (2019) ghi nhận kết quả tinh dầu lá có hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư biểu mô trực tràng và tế bào ung thư hạch bạch huyết. Các tinh dầu lá này được phân lập bằng phương pháp sắc ký khí. Phương pháp chiết xuất bằng ethanol và phân lập bằng sắc kí cột được sử dụng khi phân lập các chất tinh khiết được sử dụng trong đề tài không phân lập được các hợp chất là tinh dầu, vì vậy không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào.

- Đối với hai hợp chất tinh khiết acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D- glucuronopyranosyloleanolic, quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid, hiện naychưa ghi nhận các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của hai hợp chất này.

4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật đã được thực hiện trên sáu mẫu thử: cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn hexan của lá (LH), cao chiết phân đoạn ethyl acetat của lá (LE), cao chiết phân đoạn n-butanol của lá (LB), các chất tinh khiết LB 1.1, LB 2 trên 2 vi khuẩn vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli

(ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145); 2 vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis subsp. spizizenii (ATCC 6633), Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 25923); 2 nấm sợi: Aspergillus niger (ATCC 6275), Fusarium oxysporum (ATCC 7601); 2 nấm men: Candida albicans (ATCC 10231), Saccharomyces cerevisiae

(VTCC–Y–62). Kết quả cho thấy:

- Mẫu LB 1.1 biểu hiện hoạt tính ức chế chủng S. cerevisiae với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 12,5 µg/ml. So sánh với chứng dương, MIC của LB 1.1 kém 2,1 lần.

- Mẫu LB 1.1 biểu hiện hoạt tính ức chế chủng C. albicans với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 50 µg/ml. So sánh với chứng dương, MIC của LB 1.1 kém 4,2 lần.

- Các mẫu Cao toàn phần,LH biểu hiện hoạt tính ức chế B.subtillis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 400 µg/ml. So sánh với chứng dương, MIC của CTC,LH kém 55,6 lần - Mẫu LB biểu hiện hoạt tính ức chế chủng S. cerevisiae với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 200 µg/ml. So sánh với chứng dương, MIC của LB kém 33,6 lần.

Theo thang đánh giá của JDD Tamokou và cộng sự:

- Một dịch chiết thực vật được coi là hoạt tính cao nếu MIC <100 μg/mL; hoạt tính đáng kể khi 100 ≤ MIC ≤ 512 μg/mL; hoạt tính trung bình khi 512 < MIC ≤ 2048 μg/mL; hoạt tính yếu nếu MIC > 2048 μg/mL và không hoạt tính khi MIC > 10 mg /mL [70].

- Điểm cắt kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết có được định nghĩa như sau: hoạt tính cao: MIC dưới 1 μg/mL (hoặc 2,5 μM), hoạt tính đáng kể: 1 ≤ MIC ≤ 10 μg/mL (hoặc 2,5 ≤ MIC < 25 μM), hoạt tính trung bình: 10 < MIC ≤ 100 μg/mL (hoặc 25 < MIC ≤ 250 μM), hoạt tính yếu: 100 < MIC ≤ 1000 μg/mL (hoặc 250 < MIC ≤ 2500 μM và không có hoạt tính: MIC > 1000 μg/mL (hoặc > 2500 μM) [70].

- Các mẫu cao chiết toàn phần, LH, biểu hiện khả năng ức chế đáng kể với vi khuẩn

B.subtillis; và LB biểu hiện khả năng ức chế đáng kể chủng nấm men S. cerevisiae.

- Mẫu LB1.1 biểu hiện hoạt tính kháng nấm men mức độ trung bình với 2 chủng VSV S. cerevisiae và C. albicans.

Khoá luận lựa chọn đánh giá trên cả các dòng vi khuẩn Gr (-), vi khuẩn Gr (+), nấm sợi và nấm men nhằm định hướng phổ tác dụng của các mẫu thử. Kết quả cho thấy một số mẫu thử có tác dụng trên vi khuẩn gram dương, không tác dụng trên vi khuẩn gram âm và có tác dụng trên 2 chủng nấm men S. cerevisiae và C. albicans.

Không chỉ thử nghiệm VSV gây bệnh, để tài thực hiện thử tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn Bacillus subtilis - một lợi khuẩn tự nhiên có ở hệ vi khuẩn đường ruột của con người. Việc bổ sung vi sinh vật này vào nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết dược liệu trên một loại vi khuẩn có lợi của đường tiêu hoá. Với kết quả như trên, khoá luận đề nghị cân nhắc lợi ích - nguy cơ khi sử dụng Đinh lăng răng theo đường uống.

Mẫu LB 1.1 biểu hiện hoạt tính kháng nấm men mức độ trung bình với chủng VSV

S. cerevisiae có ý nghĩa trong việc tìm hiểu về các thuốc ung thư. Các nghiên cứu khoa học chỉ ra rằng rất nhiều hợp chất kháng nấm thường cũng có hoạt tính chống khối u, diệt bào cao. Vì vậy việc phân tích các đặc tính chống nấm và diệt bào ở các chất có hoạt tính cũng là điều cần thiết phải quan tâm. Thật vậy, nấm men Saccharomyces cerevisiae là một mô hình tuyệt vời để xác định các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc thực vật với các đặc tính chống tăng sinh. Các hợp chất có các đặc tính kháng loại nấm men này được nhận định là ứng cử viên thích hợp để nghiên cứu thêm về cơ chế kháng nấm, vì chúng có thể có đích tác dụng trên các thành phần của bộ máy điều hòa chu kỳ tế bào, và do đó có thể có các đặc tính chống tăng sinh có giá trị trong điều trị [65]. Do tính chất bảo tồn cao của bộ máy chu kỳ tế bào giữa nấm men và con người, nấm men nảy chồi là một mô hình thích hợp để nghiên cứu sự điều hòa chu kỳ tế bào, điều mà bị khiếm khuyết trong tế bào ung thư [29]. Do đó, các nghiên cứu về nấm men có liên quan trực tiếp đến việc khám phá ra thuốc chống ung thư [38] [73].

Mẫu LB 1.1 thể hiện hoạt tính kháng nấm trung bình với chủng C. albicans với MIC 50 µg/ml là một tín hiệu tích cực, mở ra tiềm năng sử dụng hợp chất LB 1.1 như một thuốc kháng C. albicans mới có nguồn gốc từ thiên nhiên. Việc sử dụng thuốc chống

nấm truyền thống kết hợp với các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có thể mang lại một cách tiếp cận mới để phòng ngừa và điều trị bệnh nấm. Cách tiếp cận như vậy có thể mở rộng phổ hoạt động và hiệu lực của từng loại thuốc; giảm độc tính; giúp nhanh chóng đạt hiệu quả kháng khuẩn, và cho phép giảm liều lượng của các tác nhân riêng lẻ, do đó ngăn ngừa sự xuất hiện của kháng kháng sinh. Ngoài ra, đề xuất thử nghiệm thêm hoạt tính kháng nấm trên các chủng nấm khác trong nhóm Candida spp. như C. auris, C. Tropicalis, C. glabrata và C. krusei. Bởi, tình trạng kháng nấm trong nhóm Candida spp. ngày càng gia tăng, cụ thể đối với các chủng C. auris, người ta đã chứng minh rằng tỷ lệ kháng thuốc echinocandin là 3,8%, và tỷ lệ này cũng tương tự đối với C. glabrata

[39]. Và, mặc dù tất cả các loài Candida đều nhạy cảm với nhóm thuốc kháng nấm polyen, nhưng việc điều trị bệnh nấm Candida do C. krusei và C. glabrata gây ra đòi hỏi sử dụng thuốc với mức liều tối đa; tuy nhiên, điều này bị hạn chế bởi độc tính trên thận của chúng [60]. Về nhóm thuốc azol kháng nấm, mặc dù thường được dung nạp tốt, azol cũng có một số hạn chế, chẳng hạn như độc tính trên gan, chủ yếu được quan sát thấy đối với clotrimazole và miconazole [40]. Hơn nữa, có những vấn đề với hiệu quả của azol. C. krusei có sự đề kháng đối với azol và C. glabrata ít nhạy cảm hơn với