Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành bằng phương pháp pha loãng trên đĩa 96 giếng.
Nguyên tắc:
Trong quá trình thử nghiệm, các giếng được bổ sung môi trường thử nghiệm. Sau đó, các nồng độ khác nhau của mẫu thử và vi khuẩn được kiểm tra được thêm vào giếng. Giếng được đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp. Sau thời gian quy định, giếng được lấy ra và kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn. Nếu môi trường trở nên đục hoặc một lớp tế bào được hình thành ở đáy thì sự phát triển của vi khuẩn đã xảy ra. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), là nồng độ thấp nhất đã ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.
Tiến hành
- Các chủng vi sinh vật được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108 vi sinh vật/ml) rồi tiến hành thí nghiệm.
- Các mẫu thử pha trong DMSO để được các dung dịch gốc có nồng độ 8 g/ml với mẫu cao chiết toàn phần và các phân đoạn; 2 g/ml với các mẫu chất tinh khiết. - Trên mỗi giếng thử của phiến 96 giếng, trộn 10 µL dung dịch mẫu thử trong
DMSO 100% với 190 µL dung dịch vi sinh vật đã hoạt hóa. Sau đó, tiếp tục pha loãng 3 lần, dải nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu: 400; 200; 100; 50 μg/ml đối với mẫu cao chiết toàn phần và các phân đoạn, 100; 50; 12,5; 6,25 µg/mL đối với các mẫu chất tinh khiết.
- Đối chứng dương: Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Streptomycin 0,1 mM, tetracylin: 0,1 mM, nystatin: 0,1mM.
- Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật thử nghiệm.
23
Đánh giá kết quả: Kết quả được xác định dựa trên sự hình thành sinh khối của VSV trong mỗi giếng thử, được xác định sau khi pha loãng và đo mật độ quang cho các vi khuẩn và nấm men, hoặc được quan sát bằng mắt thường đối với nấm sợi. Mật độ quang càng cao thì có nghĩa là sinh khối VSV càng nhiều, mẫu nào có hoạt tính kháng vi sinh vật thì sẽ làm mật độ quang giảm so với đối chứng. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (ug/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà VSV bị ức chế (khi nuôi cấy lại không có sự hình thành khuẩn lạc).
Thông số đánh giá: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ tối thiểu của kháng sinh có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn ở mức có thể quan sát được.