Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.
Nguyên tắc: Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Tiến hành:
- Tế bào ung thư được trypsin hóa, đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ trước khi hòa với dung dịch chứa mẫu thử.
- Thêm vào các giếng thử nghiệm với lượng tế bào phù hợp ( 5*103 tế bào một giếng).
- Chất thử được pha loãng bằng DMSO và đưa vào đĩa 96 giếng. Nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu: 5-10-20-40 µg/mL đối với mẫu cao phân đoạn, 1-2,5-5-10 µg/mL đối với các mẫu chất tinh khiết. Ủ trong tủ ấm nhiệt
21
độ 37oC chứa 5% CO2 trong 72 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư sẽ được sử dụng như đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau giai đoạn ủ trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định bằng TCA trong 30 phút, sau đó được nhuộm bằng SRB trong vòng 1 giờ ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acid acetic 5% rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM Tris base để hòa tan lượng SRB, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515nm.
- Phép thử được lặp lại 3 lần để tăng độ chính xác. Elipticine được sử dụng như là đối chứng dương. DMSO 10% được sử dụng như là đối chứng âm.
Tính toán kết quả:
Kết quả OD được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 515nm.
Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng.
Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
CS% = OD (mẫu) − OD (ngày O)
OD (DMSO) − OD (ngày O)× 100
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau:
Độ lệch tiêu chuẩn σ
σ = √(∑(xi − x̅)2 ) /(n − 1)
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50 . Giá trị IC50 (50% Inhibitory Concentration) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế được 50% số lượng tế bào nghiên cứu.
Cách tính giá trị IC50:
Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gíá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX
22
(Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%))
Thông số đánh giá: Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 < 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.