Dựa trên việc phân tích ưu nhược điểm của các mô hình thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hóa học (thực nghiệm đơn giản, cho kết quả có độ chính xác cao và áp dụng được cho nhiều đối tượng nghiên cứu), mô hình đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH được sử dụng trong khoá luận.
Nguyên tắc: Khi pha DPPH vào EtOH thu được một dung dịch có màu tím đặc trưng, độ đậm nhạt của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ của gốc DPPH. Khi có chất chống oxy hóa trong dung dịch, chất chống oxy hóa sẽ cho DPPH một hydro tạo thành các dẫn
Dược liệu( 4,1kg)
- Chiết với ethanol 96% tại 65oC (8 lít x 3 lần) , 4 giờ/ lần - Thu hồi dung môi
Cắn chiết ethanol (1128,54 g)
- Phân tán trong nước
- Lắc với n-hexan ( 1 lít x 3 lần) - Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước
- Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước
- Lắc với n-butanol ( 1 lít x 3 lần)
Phân đoạn n- butanol (150,54 g)
Phân đoạn nước Phân đoạn
n-hexan (282,66 g)
Phân đoạn ethyl acetat
(126,07 g)
- Thu hồi dung môi
19
xuất của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin không phải gốc tự do. Các dẫn xuất này có màu vàng, do đó màu tím đặc trưng của DPPH sẽ giảm dần, chuyển dần thành màu vàng của sản phẩm tạo ra. Khi đó, lượng gốc DPPH giảm đi chính là lượng gốc tự do đã bị “bắt”, nên tác dụng bắt gốc tự do DPPH của một chất thử sẽ tỷ lệ thuận với mức độ đổi màu của dung dịch. Do đó, ta có thể đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 515nm để xác định mức độ chống oxy hóa của chất thử.
Diphenylpicrylhydrazyl ( Gốc tự do )
Diphenylpicrylhydrazin
Hình 2.4Cơ chế dọn gốc tự do DPPH
Tiến hành:
- Pha DPPH trong ethanol 96% để được dung dịch có nồng độ 300 µM.
- Các mẫu thử pha trong DMSO để được các dung dịch gốc có nồng độ 8 g/ml với các mẫu dịch chiết thô; 2 g/ml với các mẫu chất tinh sạch.
- Trên mỗi giếng thử của phiến 96 giếng, trộn 10 µL dung dịch mẫu thử trong DMSO 100% với 190 µL dung dịch DPPH/EtOH. Sau đó, tiếp tục pha loãng 3 lần, dải nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu: 50-100-200- 400 µg/mL đối với mẫu cao chiết toàn phần và các phân đoạn; 12,5-25-50-100 µg/mL đối với các mẫu chất tinh khiết.
- Phiến thí nghiệm được bọc kín tránh ánh sáng, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút để phản ứng oxy hóa diễn ra hoàn toàn.
- Sau phản ứng tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm với máy đo quang Tecan (Tecan F150, Austria).
- Đối chứng âm là giếng thử chứa 10 µL DMSO thay cho mẫu thử.
- Đối chứng dương là acid ascorbic (Sigma-Aldicrich, USA) (nồng độ 12,5-100 µg/mL).
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên cùng phiến thử, giá trị độ hấp thụ để tính kết quả là giá trị trung bình của 3 giếng thử.
20
Tính toán kết quả:
Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình của 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn. Giá trị trung bình của SC (%) ( là tỉ lệ bắt gốc tự do của mẫu nghiên cứu ) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Excel theo công thức:
SC% = [100 −OD (mẫu thử) − OD (mẫu trắng)
OD (chứng âm tính) × 100] ± σ
Độ lệch chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau:σ = √(∑(xi− x̅)2 )/(n − 1) Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Giá trị IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, được xác định bằng phần mềm Excel qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.
Thông số đánh giá: Tác dụng bắt gốc tự do DPPH được đánh giá qua giá trị IC50. Giá trị IC50 càng nhỏ thì mẫu có hoạt tính càng cao.