Các hợp chất được phân lập bằng sắc ký cột pha thường và pha đảo. Theo dõi các phân đoạn bằng TLC và phát hiện hợp chất bằng cách nhúng trong dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT) rồi hơ nóng.
2.5.2.1. Sắc kí cột pha thuận
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel. Các bước tiến hành sắc ký cột:
+ Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh): Silica gel cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Merck) + Dung môi rửa giải (pha động): Hỗn hợp được pha từ các dung môi thường
dùng: dicloromethan, aceton, ethyl acetat, methanol và nước theo tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát qua sắc ký lớp mỏng.
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng mẫu đưa lên cột, rửa sạch, tráng cột bằng aceton, để khô, cố định trên giá theo phương thẳng đứng. Cho một lớp bông vào đáy cột.
+ Nhồi cột: Cân lượng silica gel phù hợp cho vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải, khuấy đều cho đến khi hết bọt. Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị. Mở khóa cột, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định. Giữ lại 1 ít dung môi để cột không bị khô trước khi khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột. + Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan hoàn toàn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel (tối thiểu); loại dung môi đến khi thu được bột khô và tơi hoặc có thể dùng chày sứ nghiền thành bột mịn.
+ Nạp mẫu: Đưa từ từ mẫu lên cột tránh vón thành cục và xuất hiện nhiều bọt khí. Sau khi nạp mẫu xong, thêm một lớp bông hoặc cho một lượng nhỏ silica gel lên cột để tránh xáo trộn lớp bề mặt khi tiếp dung môi.
+ Rửa giải: Cho hệ dung môi rửa giải thích hợp vào cột đã được nạp mẫu. Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô. + Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các lọ, ống nghiệm với thể tích mỗi lọ, ống
nghiệm phù hợp.
- Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng pha thường và pha đảo.
- Phát hiện hợp chất trên sắc ký lớp mỏng bằng cách nhúng trong dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT), sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu.
19
- Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất bằng TLC và phổ NMR.
2.5.2.2. Phương pháp sắc kí cột pha đảo
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha đảo. Các bước tiến hành sắc ký cột:
+ Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh): Silica gel pha đảo 75 µm YMC Co., Ltd, Nhật
+ Dung môi rửa giải (pha động): Hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng: aceton, methanol, nước theo tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát qua sắc ký lớp mỏng.
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng mẫu đưa lên cột, rửa sạch, tráng cột bằng aceton, để khô, cố định trên giá theo phương thẳng đứng. Cho một lớp bông vào đáy cột.
+ Nhồi cột: Cân lượng silica gel phù hợp cho vào cốc có mỏ, thêm methanol khuấy đều cho đến khi hết bọt. Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị. Mở khóa cột, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định. Giữ lại một ít dung môi để cột không bị khô trước khi ổn định cột bằng hệ dung môi lựa chọn. + Ổn định cột: Cho hệ dung môi (theo thứ tự giảm dần độ phân cực đến hệ bắt
đầu triển khai sắc ký cột với một lượng thể tích tùy thuộc vào cột) chảy qua cột.
+ Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan hoàn toàn. Dung môi dùng để hòa tan mẫu tốt nhất là dung môi chuẩn bị để rửa giải cột, hoặc nếu hệ dung môi rửa giải cột không đủ khả năng hòa tan với lượng tối thiểu có thể lựa chọn một dung môi khác kém phân cực hơn dung môi dùng rửa giải để hòa tan mẫu.
+ Nạp mẫu: Đưa từ từ mẫu lên cột tránh dính vào thành cột. Nếu mẫu dính lên thành cột, dùng lượng tối thiểu dung môi rửa giải để tráng sạch.
- Các giai đoạn tiếp theo là rửa giải, thu dịch, theo dõi trên sắc kí lớp mỏng tiến hành giống sắc kí cột pha thuận.