3.2.1.1. Về quy trình chiết xuất
Phương pháp dùng để chiết dược liệu là chiết nóng có hồi lưu với dung môi chiết là EtOH 70%, tỉ lệ dung dược liệu/ dung môi là 1:6 (kg/l), chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ tại nhiệt độ là 80 oC. Việc chọn phương pháp chiết nóng hồi lưu vì những ưu điểm của phương pháp này đó là: (1) Cách tiến hành và dụng cụ đơn giản; (2) Gia nhiệt trong quá trình chiết, qua đó có thể tăng được độ hòa tan của nhiều loại hợp chất, qua đó tăng được hiệu suất chiết; (3) Phù hợp với tính chất dễ bay hơi của dung môi EtOH 70%, cần sinh hàn để tránh thất thoát dung môi trong quá trình chiết; (4) Thời gian chiết ngắn hơn so với phương pháp ngâm lạnh. Trong quá trình thực nghiệm, nghiên cứu sử dụng bình cầu dung tích 5 L được cố định và gia nhiệt trong quá trình chiết. Đây cũng là một nhược điểm của phương pháp đó là dược liệu trong quá trình chiết không được khấy trộn thường xuyên, làm giảm khả năng tiếp xúc, khuếch tán các hợp chất từ dược liệu vào dung môi, do đó ảnh hưởng tới hiệu suất chiết.
Trước khi chiết, dược liệu thân rễ khô được nghiền thô, tạo ra bột thân rễ có phân bố kích thước hạt lớn. Đây có thể là ưu điểm do tăng được diện tích bề mặt dược liệu tiếp xúc dung môi, do đó tăng hiệu suất chiết nhưng cũng là nhược điểm do: (1) Dược liệu là thân rễ là bộ phận chứa nhiều tinh bột, dễ trương nở khi chiết nóng trong dung môi chứa nước, dẫn đến bã dược liệu dễ trương nở, khó khuấy trộn, giảm khả năng khuếch tán hợp chất ra dung môi; (2) Kích thước nghiền nhỏ, tỷ lệ tế bào thực vật bị phá vỡ nhiều có thể tăng tỉ lệ tạp chất hòa tan vào dịch chiết, ảnh hưởng đến khả năng phân tách sau này.
Dung môi chiết là EtOH 70% được chọn do những nguyên nhân sau: (1) Có khả năng hòa tan tốt đối với các saponin có mạch đường ngắn (loại saponin đã xuất hiện trong các nghiên cứu hóa học của loài P.vietnamensis cũng như các loài cùng chi của nó); (2) An toàn, ít độc hại, giá thành thấp, có thể dễ loại bỏ phần lớn ethanol trong dung môi chiết bằng cô loại dung môi dưới áp suất giảm do nhiệt độ sôi thấp của ethanol.
Ở bước tiếp theo của nghiên cứu, dịch chiết ethanol 70% sau khi gộp, lọc bỏ bã được cô bớt dung môi dưới áp suất giảm. Nghiên cứu này không chọn cách cô loại bỏ tối đa dung môi chiết mà chỉ cô đến một thể tích nhất định do các nguyên nhân sau: (1) Dịch chiết EtOH 70% chứa tỉ lệ lớn saponin, khi cô đặc dưới áp suất giảm rất dễ trào
32
bọt vào hệ thống sinh hàn của thiết bị cô quay chân không có sinh hàn (do saponin có tính chất diện hoạt), gây thất thoát mẫu, nhiễm tạp mẫu và gây bẩn hệ thống sinh hàn; (2) Trong quá trình cô khi dịch chiết trở nên đặc hơn thì dần xuất hiện tủa. Phần tủa này keo, nhớt, không tan hoàn toàn trong nước nên gợi ý rằng nó không phải là các muối vô cơ mà có thể là các hợp chất hữu cơ kết tủa từ dịch chiết cô đặc. Nghiên cứu này lựa chọn tách phần tủa này để làm mẫu thô phân tách các hợp chất saponin từ dịch chiết tổng do tỉ lệ các hợp chất hữu cơ (trong đó có cả các hợp chất saponin) ở phần tủa rắn sẽ cao hơn phần dịch chiết sau ly tâm. Ngoài ra khối lượng khô của phần tủa cũng khá lớn (567,0 g), dẫn đến khối lượng các hợp chất tinh khiết có thể phân lập được lớn hơn, qua đó có thể đảm bảo đủ lượng hợp chất tinh khiết để xác định cấu trúc hóa học hay nghiên cứu tác dụng dược lý của hợp chất tinh khiết đó. Tuy nhiên, so với chọn nghiên cứu phần tủa, việc chọn nghiên cứu phần dịch chiết sau ly tâm có thể có ưu điểm là dễ dàng thực hiện chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, n-butanol để tạo thành các phân đoạn thô ban đầu, phục vụ cho quá trình phân lập các hợp chất ở các gian đoạn sau. Đặc biệt, n-butanol là một dung môi hòa tan tương đối chọn lọc các saponin có mạch đường ngắn tới trung bình nên thường được dùng để tinh chế saponin bằng cách chiết lỏng-lỏng với dịch chiết nước. Trong nghiên cứu này, phần dịch chiết sau ly tâm cũng được chiết lỏng-lỏng với dung môi n-butanol, tỉ lệ 1:1, tiến hành 3 lần, cô loại dung môi thu được cao n-butanol. Tuy nhiên do hướng nghiên cứu của đề tài tập trung vào việc phân tách các hợp chất saponin từ phần tủa sau ly tâm nên quá trình phân tách các hợp chất saponin từ phần dịch chiết sau ly tâm sẽ được đề cập tại các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp tách tủa khỏi phần dịch chiết cô đặc là phương pháp ly tâm vì phần tủa này keo, nhớt, các phương pháp lọc qua màng lọc thông thường không hiệu quả do dễ bị tắc màng lọc, kéo dài thời gian lọc. Ngoài ra, phần dịch chiết đặc, độ nhớt cao cũng làm tăng thời gian lọc trên màng lọc. Trong khi đó phương pháp ly tâm là phương pháp hiệu để tách huyền phù, nên đã được áp dụng trong trường hợp này.
Kết quả thu được khối lượng tủa sau sấy là 567,0 g, so với khối lượng dược liệu ban đầu là 5 kg thì khối lượng tủa thu được chiếm 11,34% so với dược liệu khô ban đầu.
3.2.1.2. Về quy trình phân lập các hợp chất
Quá trình phân lập các hợp chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột thường quy, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mô phòng thí
33
nghiệm. Việc lực chọn phân đoạn, loại sắc ký pha thuận hay đảo, loại dung môi nào để tiến hành sắc ký cột phân tách các hợp chất được khảo sát trên sắc ký lớp mỏng trước khi tiến hành sắc ký cột.
Trong nghiên cứu có quy trình xử lý phần tủa bằng sắc ký cột khác so với thường quy. Theo quy trình thường quy, dịch chiết tổng (hoặc cao tổng) được chiết phân bố lỏng-lỏng lần lượt các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat , n-butanol để thu được các dịch chiết tương ứng và phần cắn nước cuối cùng. Trong nghiên cứu này, hàm lượng saponin lớn trong phần tủa sau ly tâm dễ tạo huyền phù, nhũ hóa nên gây khó khăn cho quá trình chiết lỏng-lỏng. Do đó, phần tủa không được chiết lỏng lỏng mà được xử lý bằng sắc kí cột pha thường với các hệ dung môi lần lượt là dicloromethan, ethyl acetat và hệ dung môi dicloromethan - methanol (9:1; 7:3, tt/tt) và methanol. Ở đây, dicloromethan, ethyl acetat lần lượt thêm vào có tác dụng loại phần tạp ít phân cực ra khỏi phần tủa giàu saponin do các hợp chất này dễ tan trong hai dung môi kém phân cực này và bị rửa giải ra trước, tương tự tác dụng khi chiết phân bố lỏng-lỏng với hai dung môi này trong quy trình thường quy. Phương pháp này có một số ưu điểm như: (1) Có thể giảm lượng dung môi sử dụng nhưng không ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tách các phân đoạn khác khỏi phần tủa cũng như các bước phân lập tiếp theo; (2) Quá trình chiết lỏng-lỏng có thể gặp vấn đề hòa tan mẫu, nhũ hóa trong khi lắc, khó phân tách lớp hoàn toàn trong khi phương pháp sắc kí cột nêu trên không gặp vấn đề này. Sau khi đã loại các tạp ít phân cực, các dung môi độ phân cực lớn hơn là dicloromethan - methanol (9:1; 7:3, tt/tt) lần lượt được sử dụng để rửa giải phân đoạn giàu saponin còn lại, phân tách chúng vào các phân đoạn mới.
Các quá trình phân lập bằng sắc ký cột sau đó được tiến hành theo quy trình thường quy, kết quả phân lập được hai hợp chất đó là PV-5A3 và PV-8B2. Các dữ liệu về dạng thù hình, nhiệt độ nóng chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối, so sánh với các dữ liệu đã công bố, đã xác định được PV-5A3 và PV-8B2 lần lượt là paris saponin H
và ophiopogonin C′ hay paris saponin V. Đây là hai hợp chất đã được phân lập từ loài
Paris vietnamesis (Takht) H.Li từ các nghiên cứu trước đó [64].