Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên: - Các tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy).
20
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, (1H-, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC...) + Phổ khối (ESI-MS)
- Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo.
21
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất.
3.1.1. Kết quả chiết xuất và phân lập
Quy trình chiết xuất và thu tủa từ hỗn dịch chiết tổng được thể hiện ở Hình 3.1
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất và thu tủa từ dịch chiết tổng
5,0 kg dược liệu thân rễ Bảy lá một hoa Việt Nam khô sau khi xay nhỏ, được chiết nóng với EtOH 70% 3 lần, mỗi lần 3 h ở 80°C, tỉ lệ dược liệu/ dung môi là 1:6 (kg/l). Lọc loại bã dược liệu và gom dịch chiết thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi xuất hiện tủa. Ly lâm tách tủa và dịch. Phần tủa sau khi ly tâm làm khô bằng tủ sấy thu được 567,0 g. Phần dịch ly tâm được chiết phân bố lỏng – lỏng với dung môi n-butanol, chiết 3 lần, tỉ lệ 1:1 (tt/tt), gạn lớp lấy bên trên, gộp dịch gạn thu được phân đoạn n- butanol, cô loại n-butanol dưới áp suất giảm rồi làm khô trong tủ hút thu được 95,0 g
22
cao n-butanol. Phần dịch nước sau chiết lỏng – lỏng đem cô loại nước thu được 180,0 g cắn nước.
Sắc kí đồ các phân đoạn thô được chiết xuất từ thân rễ Bảy lá một hoa Việt Nam được thể hiện qua Hình 3.2.
A B
Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn thô sau quá trình chiết xuất
Hệ dung môi ethyl acetat - methanol - nước (80:15:5, tt/tt/tt)
A: Quan sát ở UV 254 nm.
B: Quan sát ở ánh sáng thường sau khi nhúng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol
(TT) rồi hơ nóng.
Phần tủa (567,0 g) sau khi lưu mẫu (12,0 g) được chia nhỏ thành 17 phân đoạn (1A-1R) bằng sắc ký cột silica gel pha thuận và rửa giải bằng dicloromethan (100%), ethyl acetat (100%), hệ dung môi dicloromethan - methanol (9:1, 7:3, tt/tt) và methanol (100%).
Phân tách phân đoạn 1M (20,0 g) bằng sắc ký cột silica gel với dung môi rửa giải dicloromethan - methanol (8:2 - 4:6, tt/tt) thu được 6 phân đoạn (3A-3F).
Phân đoạn 3E (5,0 g) được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi aceton - nước (6:4, tt/tt) thu được 4 phân đoạn (5A-5D).
Tinh chế phân đoạn 5A (2,0 g) bằng sắc ký cột pha đảo với dung môi rửa giải aceton - nước (6:4, 7:3, tt/tt) thu được 40,0 mg hợp chất PV-5A3.
Hợp chất PV-8B2 (15,0 mg) thu được từ phân đoạn 5C (1,0 g) bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là ethyl acetat - methanol - nước (85:10:5, tt/tt/tt).
23
Sắc ký đồ của các hợp chất phân lập so với cao tổng và tủa (ly tâm) được thể hiện qua Hình 3.3.
A B
Hình 3.3. Sắc ký đồ của các hợp chất phân lập
A: Sắc kí đồ pha thuận với hệ dung môi cloroform - ethyl acetat - methanol - nước
(6:38:11:10, tt/tt/tt/tt) sau khi nhúng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT) rồi hơ nóng.
B: Sắc kí đồ pha thuận với hệ dung môi aceton - nước (8:2, tt/tt) sau khi nhúng dung
dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT) rồi hơ nóng.
E70: Dịch chiết tổng EtOH 70%;
Tủa: Kết tủa sau khi ly tâm khỏi dịch chiết cô đặc 8B2: Hợp chất PV-8B2;
5A3: Hợp chất PV-5A3.
Quy trình phân lập hai hợp chất PV-5A3 và PV-8B2 được thể hiện tóm tắt qua Hình 3.3.
24
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình phân lập hai hợp chất PV-5A3 và PV-8B2
3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập
3.1.2.1. Hợp chất PV-8B2
Dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR (500 MHz, pyridin-d5) & 13C-NMR (125 MHz, pyridin-d5): xem Bảng 3.1. Phổ ESI-MS: m/z 745,65 [M+Na]+; 721,6 [M-H]-.
Hợp chất PV-8B2 phân lập có dạng bột màu trắng. Phổ 1D-NMR (Bảng 3.1) của
PV-8B2 cho các tín hiệu đặc trưng của một saponin spirostan khung diosgenin với 4 nhóm methyl tại δH 0,68 (d, J = 6,0 Hz), 0,81 (s), 1,04 (s), 1,12 (d, J = 7,0 Hz); tín hiệu của một proton thế ba lần tại δH 5,29 (brd, J = 0,5 Hz) và 27 carbon trong đó có hai
nhóm methin tại δC 62,7 (C-17), 81,1 (C-16) và 1 carbon spirostan tại δC 109,2 (C-22). Vị trí C-3 được xác định tại δC 78,0 bằng tương tác trực tiếp H→C trên phổ HSQC. Phổ
13C-NMR và DEPT của PV-8B2 cho thấy tín hiệu của 39 carbon trong đó có 27 carbon diosgenin và 12 carbon thuộc phần glycosid gồm 2 gốc đường 6 carbon. Mặt khác trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 2 proton anomeric tại δH 5,02 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′),
25
6,35 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1ʺ) với hằng số tương tác proton anomeric là 7,5 và 1,5 Hz xác định cấu hình β và α tương ứng của glucopyranosyl và rhamnopyranosyl. Tín hiệu proton douplet tại δH 1,72 (d, J = 6,0 Hz) đặc trưng nhóm methyl của rhamnose. Tương tác H→C trực tiếp trên phổ HSQC xác định độ chuyển dịch hóa học của 2 carbon anomeric tương ứng tại δC 100,4 và 102,1.
Tương tác HMBC giữa H-1ʹ (δH 5,02) với aglyon C-3 (δC 78,0), chuỗi tương tác
quan sát được trên phổ COSY gồm H-1ʹ/ H-2ʹ/ H-3ʹ/ H-4ʹ/ H-5ʹ/ H-6′ cùng với các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn vị đường glucose và liên kết O-glycosid của đường này với aglycon tại C-3. Tương tác HMBC giữa H-1ʺ (δH 6,35) và C-2ʹ (δC 77,9)/ C-3″ (δC 72,8)/ C-5″ (δC 69,5), cùng với chuỗi các tương tác COSY H-2ʺ/ H-3ʺ/ H-4ʺ/ H-5ʺ/ H-6ʺ và các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn vị đường rhamnose và liên kết (1→2) giữa đơn vị đường rhamnose với đơn vị đường glucose.
Phổ khối ESI-MS (Phụ lục 4.7) xuất hiện pic ion tại m/z 745,65 [M+Na]+
(positive) và 721,6 [M-H]- (negative) phù hợp với công thức phân tử là C39H62O12 (M = 722,4).
Từ những dữ liệu phổ NMR và MS của PV-8B2 kết hợp với tài liệu tham khảo [15] có thể kết luận PV-8B2 là diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D- glycopyranosid hay ophiopogonin C′ (Hình 3.4).
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PV-8B2 và ophiopogonin C′
STT
PV-8B2 (Pyridin-d5) Ophiopogonin C′ (Pyridin-d5) [15]
1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) 1H-NMR (400 MHz) 13C-NMR (100 MHz) 1 37,5 37,5 2 30,2 30,2 3 3,93 (1H, m) 78,0 77,9 4 39,0 38,9 5 140,9 140,8 6 5,29 (1H, brd, 0,5) 121,7 5,29 (1H, br s) 121,7 7 32,2 32,2
26 8 31,7 31,7 9 50,3 50,3 10 37,1 37,1 11 21,1 21,1 12 39,9 39,8 13 40,5 40,4 14 56,6 56,6 15 32,3 32,3 16 4,54 (1H, m) 81,1 81,1 17 62,7 62,6 18 0,81 (3H, s) 16,3 0,81 (3H, s) 16,3 19 1,04 (3H, s) 19,4 1,04 (3H, s) 19,4 20 42,0 41,9 21 1,12 (3H, d, 7,0) 15,0 1,13 (3H, d, 6,8) 15,0 22 109,2 109,3 23 31,8 31,8 24 29,3 29,3 25 30,6 30,6 26 3,48 (1H, m) 3,57 (1H, m) 66,9 66,8 27 0,68 (3H, d, 6,0) 17,3 0,68 (3H, d, 4,4) 17,3 3-OGlc 1′ 5,02 (1H, d, 7,5) 100,4 100,3 2′ 4,24 (1H, m) 77,9 77,8 3′ 4,14 (1H, m) 71,8 71,8 4′ 3,87 (1H, m) 78,2 78,3 5′ 4,26 (1H, m) 79,6 79,6 6′ 4,29 (1H, m) 4,50 (1H, m) 62,9 62,9 2ʹ-Rha 1ʺ 6,35 (1H, d, 1,5) 102,1 6,37 (1H, brs) 102,0
27 2ʺ 4,78 (1H, m) 72,6 72,6 3ʺ 4,60 (1H, dd, 3,0; 9,0) 72,8 72,8 4ʺ 4,32 (1H, m) 74,2 74,1 5ʺ 4,96 (1H, m) 69,5 69,5 6ʺ 1,75 (3H, d, 6,0) 18,7 18,7
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (→) của hợp chất PV-8B2
3.1.2.2. Hợp chất PV-5A3
Dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR (500 MHz, pyridin-d5) & 13C-NMR (125 MHz, pyridin-d5): Bảng 3.2. Phổ ESI-MS: m/z 893,65 [M+Na]+, 869,65 [M-H]-.
Hợp chất PV-5A3 có dạng bột màu trắng, có nhiệt nóng chảy 281-283°C. Phổ 1D- NM của PV-5A3 xuất hiện các tín hiện đặc trưng của một saponin spirostan khung pennogenin với 4 nhóm methyl tại δH 0,63 (d, J = 5,5 Hz), 0,90 (s), 1,01 (s) và 1,18 (d,
J = 7,0 Hz); 1 proton thế ba lần tại δH 5,26 (d, J = 5,0 Hz); 1 carbon spirostan tại δC 109,8 (C-22) và hai tín hiệu carbon tại δC 89,7 (C-16) và 90,0 (C-17). Phổ 13C-NMR, DEPT của PV-5A3 cho tín hiệu của 44 carbon trong đó có 27 carbon thuộc khung pennogenin và 17 carbon của 3 phân tử đường gồm 2 phân tử đường 6 carbon và 1 phân tử đường 5 carbon. Phổ 1H-NMR cũng cho tín hiệu của 3 proton anomeric tại δH 4,85 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 5,81 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-1‴Ara) và 6,14 (1H, s, H-1ʺRha). Hằng số tương tác của proton anomeric là 7,6 Hz xác định cấu hình β của glucopyranosyl. Dạng pic singlet của các proton 6,14 và hằng số ghép bằng 2,0 Hz xác định cấu hình α của 2 gốc đường rhamnopyranosyl và arabinofuranosyl. Thông qua tương tác H→C trên phổ HSQC xác định độ chuyển dịch hóa học của carbon anomeric tại δC 99,9 (C-1′),
28
109,7 (C-1‴) và 101,7 (C-1″). Mặt khác 2 tín hiệu nhóm hydroxymethylen tại δC 61,0 và 62,2 và tín hiệu methyl tại δH 1,69 (d, J = 6,0 Hz) và δC 18,4 xác định chuỗi đường gồm 1 phân tử glucose, 1 phân tử arabinose và 1 phân tử đường rhamnose.
Tương tác HMBC giữa H-1ʹ (δH 4,85) với aglycon C-3 (δC 78,0) và chuỗi tương
tác 1H-1H quan sát được trên phổ COSY gồm H-1ʹ/ H-2ʹ/ H-3ʹ/ H-4ʹ/ H-5ʹ/ H-6′ cùng với các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn vị đường glucose và liên kết O-glycosid của đường này với aglycon tại C-3. Tương tác HMBC giữa H-1ʺ (δH 6,14) và C-2ʹ (δC 77,4) cùng với chuỗi các tương
tác COSY H-1″/H-2ʺ/ H-3ʺ/ H-4ʺ/ H-5ʺ/ H-6ʺ và các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn vị đường rhamnose và liên kết (1→2) giữa đơn vị đường rhamnose với đơn vị đường glucose. Vị trí của gốc đường thứ 3 cũng được xác định tương tự dựa trên tương tác HMBC giữa H-1‴ (δH 5,81) và C- 4ʹ (δC 76,3) cùng với chuỗi các tương tác COSY H-1‴/H-2‴/ H-3‴/ H-4‴/ H-5‴/ H-6‴ và
các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn vị đường arabinose và liên kết (1→4) giữa đơn vị đường arabinose với đơn vị đường glucose. Từ các phân tích trên, phần đường của PV-5A3 được xác định là 3-
O-α-L-arabinofuranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranonsyl-(1→2)]-β-D-glucsopyranosid.
Phổ khối ESI-MS (Phụ lục 5.7) của PV-5A3 xuất hiện pic ion giả phân tử tại 893,65 [M+Na]+ (positive) và 869,65 [M-H]- (negative) phù hợp với công thức phân tử là C44H70O17 (M = 870,5).
Kết quả phân tích phổ 1D, 2D và MS, kết hợp so sánh với tài liệu [65], có thể kết luận PV-5A3 là pennogenin-3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranonsyl- (1→2)]-β-D-glucsopyranosid hay paris saponin H (Hình 3.5).
29
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PV-5A3 và paris saponin H
STT
PV-5A3 (Pyridin-d5) Paris saponin H (Pyridin-d5) [65]
1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) 1 37,3 37,9 2 29,9 30,5 3 3,78 (1H, m) 78,0 78,2 4 38,7 39,2 5 140,6 141,0 6 5,26 (1H, d, 5,0) 121,7 5,28 (1H, br s) 122,1 7 32,1 32,7 8 31,6 32,1 9 50,0 50,5 10 36,9 37,5 11 20,7 21,3 12 31,9 32,4 13 44,9 45,5 14 52,8 53,3 15 32,2 32,7 16 4,42 (1H, t, 2,0) 89,7 90,3 17 90,0 90,5 18 0,90 (3H, s) 16,9 0,96 (3H, s) 17,5 19 1,01 (3H, s) 19,2 1,08 (3H, s) 19,8 20 44,6 45,1 21 1,18 (3H, d, 7,0) 9,5 1,23 (3H, d, 7,0) 10,1 22 109,8 109,9 23 31,8 32,4 24 28,6 29,1 25 30,2 30,8 26 3,48 (2H, m) 66,6 67,0 27 0,63 (3H, d, 5,5) 17,1 0,69 (3H, d, 5,5) 17,6
30 3-OGlc 1′ 4,85 (1H, d, 7,5) 99,9 4,95 (1H, d, 7,5) 100,4 2′ 4,08 (1H, m) 77,4 77,7 3′ 4,13 (1H, m) 77,3 78,0 4′ 3,71 (1H, m) 76,3 77,0 5′ 4,13 (1H, m) 77,2 77,3 6′ 4,12 (1H, m) 4,20 (1H, m) 61,0 61,7 2ʹ-Rha 1ʺ 6,14 (1H, s) 101,7 6,29 (1H, s) 102,2 2ʺ 4,70 (1H, m) 72,0 72,8 3ʺ 4,51 (1H, m) 72,4 73,1 4ʺ 4,28 (1H, m) 73,6 74,4 5ʺ 4,84 (1H, m) 69,3 69,8 6ʺ 1,69 (3H, d, 6,0) 18,4 1,77 (3H, d, 6,0) 19,0 4ʹ-Ara 1‴ 5,81 (1H, d, 2,0) 109,4 5,93 (1H, s) 110,1 2‴ 4,80 (1H, m) 82,4 83,0 3‴ 4,77 (1H, m) 77,5 78,4 4‴ 4,80 (1H, m) 86,1 87,0 5‴ 4,09 (1H, m) 4,18 (1H, m) 62,2 62,8
31
3.2. Bàn luận
3.2.1. Về kết quả chiết xuất, phân lập các hợp chất
3.2.1.1. Về quy trình chiết xuất
Phương pháp dùng để chiết dược liệu là chiết nóng có hồi lưu với dung môi chiết là EtOH 70%, tỉ lệ dung dược liệu/ dung môi là 1:6 (kg/l), chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ tại nhiệt độ là 80 oC. Việc chọn phương pháp chiết nóng hồi lưu vì những ưu điểm của phương pháp này đó là: (1) Cách tiến hành và dụng cụ đơn giản; (2) Gia nhiệt trong quá trình chiết, qua đó có thể tăng được độ hòa tan của nhiều loại hợp chất, qua đó tăng được hiệu suất chiết; (3) Phù hợp với tính chất dễ bay hơi của dung môi EtOH 70%, cần sinh hàn để tránh thất thoát dung môi trong quá trình chiết; (4) Thời gian chiết ngắn hơn so với phương pháp ngâm lạnh. Trong quá trình thực nghiệm, nghiên cứu sử dụng bình cầu dung tích 5 L được cố định và gia nhiệt trong quá trình chiết. Đây cũng là một nhược điểm của phương pháp đó là dược liệu trong quá trình chiết không được khấy trộn thường xuyên, làm giảm khả năng tiếp xúc, khuếch tán các hợp chất từ dược liệu vào dung môi, do đó ảnh hưởng tới hiệu suất chiết.
Trước khi chiết, dược liệu thân rễ khô được nghiền thô, tạo ra bột thân rễ có phân bố kích thước hạt lớn. Đây có thể là ưu điểm do tăng được diện tích bề mặt dược liệu tiếp xúc dung môi, do đó tăng hiệu suất chiết nhưng cũng là nhược điểm do: (1) Dược liệu là thân rễ là bộ phận chứa nhiều tinh bột, dễ trương nở khi chiết nóng trong dung môi chứa nước, dẫn đến bã dược liệu dễ trương nở, khó khuấy trộn, giảm khả năng khuếch tán hợp chất ra dung môi; (2) Kích thước nghiền nhỏ, tỷ lệ tế bào thực vật bị phá vỡ nhiều có thể tăng tỉ lệ tạp chất hòa tan vào dịch chiết, ảnh hưởng đến khả năng phân tách sau này.
Dung môi chiết là EtOH 70% được chọn do những nguyên nhân sau: (1) Có khả năng hòa tan tốt đối với các saponin có mạch đường ngắn (loại saponin đã xuất hiện trong các nghiên cứu hóa học của loài P.vietnamensis cũng như các loài cùng chi của nó); (2) An toàn, ít độc hại, giá thành thấp, có thể dễ loại bỏ phần lớn ethanol trong dung môi chiết bằng cô loại dung môi dưới áp suất giảm do nhiệt độ sôi thấp của ethanol.
Ở bước tiếp theo của nghiên cứu, dịch chiết ethanol 70% sau khi gộp, lọc bỏ bã được cô bớt dung môi dưới áp suất giảm. Nghiên cứu này không chọn cách cô loại bỏ tối đa dung môi chiết mà chỉ cô đến một thể tích nhất định do các nguyên nhân sau: (1) Dịch chiết EtOH 70% chứa tỉ lệ lớn saponin, khi cô đặc dưới áp suất giảm rất dễ trào
32
bọt vào hệ thống sinh hàn của thiết bị cô quay chân không có sinh hàn (do saponin có tính chất diện hoạt), gây thất thoát mẫu, nhiễm tạp mẫu và gây bẩn hệ thống sinh hàn; (2) Trong quá trình cô khi dịch chiết trở nên đặc hơn thì dần xuất hiện tủa. Phần tủa này keo, nhớt, không tan hoàn toàn trong nước nên gợi ý rằng nó không phải là các muối vô cơ mà có thể là các hợp chất hữu cơ kết tủa từ dịch chiết cô đặc. Nghiên cứu này lựa chọn tách phần tủa này để làm mẫu thô phân tách các hợp chất saponin từ dịch chiết tổng do tỉ lệ các hợp chất hữu cơ (trong đó có cả các hợp chất saponin) ở phần tủa rắn sẽ cao hơn phần dịch chiết sau ly tâm. Ngoài ra khối lượng khô của phần tủa cũng khá lớn (567,0 g), dẫn đến khối lượng các hợp chất tinh khiết có thể phân lập được lớn hơn, qua đó có thể đảm bảo đủ lượng hợp chất tinh khiết để xác định cấu trúc hóa học hay nghiên cứu tác dụng dược lý của hợp chất tinh khiết đó. Tuy nhiên, so với chọn nghiên cứu phần tủa, việc chọn nghiên cứu phần dịch chiết sau ly tâm có thể có ưu điểm là dễ dàng thực hiện chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, n-butanol để tạo thành các phân đoạn thô ban đầu, phục vụ cho quá trình phân lập các hợp chất ở các gian đoạn sau. Đặc biệt, n-butanol là một dung môi hòa tan tương đối chọn lọc các saponin có mạch đường ngắn tới trung bình nên thường được dùng để tinh chế saponin bằng cách chiết lỏng-lỏng với dịch chiết nước. Trong nghiên cứu này, phần dịch chiết sau ly tâm cũng được chiết lỏng-lỏng với dung môi n-butanol, tỉ lệ 1:1, tiến hành 3 lần, cô loại dung môi thu được cao n-butanol. Tuy nhiên do hướng nghiên cứu của đề tài tập trung vào việc phân tách các hợp chất saponin từ phần tủa sau ly tâm nên quá trình phân tách các hợp chất saponin từ phần dịch chiết sau ly tâm sẽ được đề cập tại các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp tách tủa khỏi phần dịch chiết cô đặc là phương pháp ly tâm vì phần tủa này keo, nhớt, các phương pháp lọc qua màng lọc thông thường không hiệu quả do dễ bị tắc màng lọc, kéo dài thời gian lọc. Ngoài ra, phần dịch chiết đặc, độ nhớt cao cũng làm tăng thời gian lọc trên màng lọc. Trong khi đó phương pháp ly tâm là phương pháp hiệu để tách huyền phù, nên đã được áp dụng trong trường hợp này.