2.1.3.1. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng 1H-NMR
Để chứng minh tổng hợp thành công copolymer vật liệu được hòa tan
trong dung môi deuterated chloroform (CDCl3) hoặc nước D2O khảo sát
cấu trúc bằng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Advance 500MHz,
USA, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với
chất chuẩn là tetramethyl silane (TMS) có độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) bằng không. Dựa vào sự xuất hiện độ chuyển dịch hóa học của các proton trên phổ đồ sẽ biết được sự có mặt của các proton trên các nhóm thế khác nhau.
2.1.3.2. Phổ hồng ngoại (FT-IR)
Sử dụng phương pháp nén viên KBr và xác định phổ hấp thụ hồng ngoại
từ khoảng 4000-500 cm-1 bằng thiết bị FT-IR/NIR Spectroscopy Frontier đặt
tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chuẩn bị mẫu thử: nghiền 2 mg mẫu thử với 100 mg bột mịn KBr (dùng cho IR) đã được sấy khô, đủ để tạo thành 1 viên nén có đường kính 13 mm và cho phổ có cường độ phù hợp. Hỗn hợp được nghiền cẩn thận và rải đều trên một khuôn thích hợp. Nén khuôn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng 800 Mpa trong điều kiện chân không. Tiến hành đo phổ IR.
2.1.3.3. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis)
Phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200-800 nm.
Phổ UV-Vis được đo trên thiết bị UV-1800 Shimadzu đặt tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT TRÊN CƠ SỞ CHITOSANVÀ PLURONIC F127 VÀ PLURONIC F127
Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tổng hợp hệ hydrogel nhạy nhiệt trên cơ sở chitosan và Pluronic F127 thông qua liên kết của nhóm amine trên chitosan và nhóm (–C=O) của hợp chất carbonate (NPC). Sản phẩm của phản ứng Pluronic sau khi hoạt hóa bằng p-nitrophenyl
chloroformate (NPC) được xác định cấu trúc thông qua phổ 1HNMR, FT-IR.
Hydrogel chitosan- Pluronic (CP) được tổng hợp qua 3 giai đoạn trung gian hình 2.1. thể hiện sơ đồ tổng hợp chitosan- Pluronic F127 (CS -F127),
Hình 2.1. Quy trình tổng hợp hệ hydrogel CS -F127
2.2.1. Tổng hợp NPC-F127-NPC
Hình 2.3. Quy trình tổng hợp NPC-F127-NPC
Quy trình phản ứng
Cân 15 gam F127 (1,2 mmol) nóng chảy trong bình cầu 250 mL ở nhiệt độ 65 °C trong môi trường hút chân không khoảng 1 giờ 30 phút để F127 tan chảy hoàn toàn và đồng thời không có độ ẩm trong mẫu. Sau đó 0,5 g NPC
(2,4 mmol) cho vào bình cầu, khuấy ở nhiệt độ 65 °C, môi trường khí N2
trong 5 giờ. Giảm nhiệt độ xuống, cho 40 mL THF vào khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm. Dung dịch được tủa với 250 mL diethyl ether. Tủa thu được thông qua lọc hút chân không, tiếp tục rửa lại với diethyl ether khoảng 2-3 lần. Sau đó, đem sản phẩm đi cô quay loại bỏ hết dung môi. Sản phẩm thu được có dạng bột màu trắng mịn, cấu trúc pluronic F127 sau khi hoạt hoá
2.2.2. Tổng hợp NPC-F127-OH
Để ngăn sự hình thành F127–dimer do nhóm NPC rất dễ dàng bị thay thế, một lượng dư 3-amino-1-propanol được sử dụng để khoá một đầu NPC trên mạch của Pluronic đã được hoạt hoá.
Hình 2.4. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH
Quy trình phản ứng
Cân 15 g NPC-F127-NPC hòa tan với 50 ml THF trong bình cầu, cho 0,1 mL 3-amino-1-propanol (1,2 mmol và d = 0,982 gam/L) pha loãng dung dịch bằng 40 mL THF, nhỏ giọt từ từ vào bình cầu, khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch thu được đem đi tủa trong 250 mL diethyl ether. Sau đó, hỗn hợp được lọc hút chân không, sản phẩm được đem đi cô quay để loại hoàn toàn dung môi còn sót lại đến khối lượng không đổi. Sản phẩm thu được có màu trắng mịn, cấu trúc NPC-F127-NPC sau khi gắn với 3-
amino-1-propanol được xác định bằng phổ 1H-NMR.
2.2.3. Tổng hợp hệ copolymer ghép chitosan-g- Pluronic F127 (CS -F127) F127)
Tổng hợp chitosan- Pluronic F127 (CS -F127) với các tỷ lệ khác nhau
Cân 0,5 g chitosan hoà tan thêm 20mL nước DI, dùng axit HCl (1M) chỉnh pH xuống 4, khuấy đều cho đến khi chitosan tan hoàn toàn trong nước. Tương ứng với tỷ lệ ghép chitosan : Pluronic (1:5; 1:10; 1:15; 1:20) cân NPC–F127- OH có khối lượng lần lượt (2,5; 5,0; 7,5; 10 g) hoà tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C, khuấy từ 1 giờ rồi đem giữ ở nhiệt độ 4 °C trong 12 giờ. Dung dịch NPC-F127-OH được cho vào dung dịch chitosan khuấy và giữ lạnh ít nhất 24 h trước khi đem thẩm tách với mang cellulose (12.000-14.000 Da). Thẩm tách trong nước cất diễn ra trong khoảng một tuần trước khi đem
mẫu đi đông khô. Sản phẩm thu được đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu
trúc.
2.3. TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT TRÊN CƠ SỞ ALGINATE VÀ PLURONIC F127
2.3.1. Tổng hợp dẫn xuất Alginate-cystamine (Na-Alg-Cys)
Tổng hợp dẫn xuất Alginate-cystamine (Na-Alg-Cys) được thể hiện qua sơ đồ phản ứng hình 2.6.
Hình 2.6.Sơ đồ phản ứng của quá trình tổng hợp Na-Alg-Cys
Thuyết minh quy trình: 1g Sodium alginate (Alg) được hòa tan vào
DMSO: H2O (1:1 theo thể tích). Sau khi hỗn hợp đạt được sự đồng nhất, điều
chỉnh pH của dung dịch Alg về khoảng 5,5 bằng HCl 0,1M. Hỗn hợp N-(3- Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) và N- hydroxysucinimide (NHS) (tỷ lệ số mol 1:1=4,6 mmol) được pha vào cùng môi trường dùng hòa tan Alg, hoạt hóa trong vòng 30 phút. 4,6 mmol
Cystamine (Cys) được hòa tan trong H2O và được nhỏ giọt vào hỗn hợp dung
dịch Alg/EDC/NHS đang được khuấy ở tốc độ 1000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp tiếp tục được khuấy ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ sau đó sử dụng phương pháp thẩm tách bằng màng cellulose (MCWO~12- 14KDa) trong môi trường nước cất để loại bỏ Cys không phản ứng, chất hoạt hóa và các dung môi đã sử dụng. Phần dung dịch trong túi thẩm tách sau đó được đem sấy thăng hoa thu sản phẩm dạng bột. Sản phẩm sau đó được dùng
để đánh giá cấu trúc bằng FTIR và 1H-NMR.
2.3.2. Tổng hợp copolymer ghép alginate-g- Pluronic F127(Alg -F127)
Quy trình tổng hợp giống quy trình đã được trình bày ở chitosan hình 2.5.
Hình 2.7. Sơ đồ tổng hợp copolymer nhạy cảm nhiệt Alg -F127 Đầu tiên, 0,5g Na-Alg-Cys hòa tan vào 20 mL nước cất đến khi đồng nhất sau đó mẫu tiếp tục khấy trong môi trường lạnh, nhiệt độ dưới 15 °C. Tương ứng với tỷ lệ ghép Alginate : Pluronic (1:5; 1:10; 1:15; 1:20) cân NPC–F127- OH có khối lượng lần lượt (2,5; 5,0; 7,5; 10 g) hoà tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C, khuấy từ cho đến khi tan hoàn toàn. Dung dịch NPC-F127-OH được cho vào dung dịch Na-Alg-Cys khuấy và giữ lạnh ít nhất 24 h trước khi đem thẩm tách với mang cellulose (12.000-14.000 Da). Thẩm tách trong nước cất diễn ra trong khoảng 7 ngày trước khi đem mẫu đi đông
khô. Sản phẩm thu được đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc.
2.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER LÊNNHIỆT ĐỘ TẠO GEL NHIỆT ĐỘ TẠO GEL
2.4.1. Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS -F127
Copolymer ghép CS -F127 được hoà tan hoàn toàn trong các ống nghiệm chứa nước cất (5, 8, 10, 12, 15 và 20 % w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt. Đánh giá khả năng nhạy nhiệt của dung dịch copolymer ghép bằng phương pháp khảo sát sự chuyển trạng thái sol-gel của dung dịch chitosan- Pluronic F127 ở khoảng nhiệt độ tử 15 đến 50 °C. Các hydrogel được điều chế với các tỷ lệ Pluronic F127 khác nhau và cố định hàm lượng chitosan. Các mẫu hydrogel có hàm lượng chitosan so với Pluronic là 1:5, 1:10, 1:15, 1:20
%wt/wt. Các vật liệu này khi pha trong nước lạnh dưới dưới 10 °C để đảm bảo sự hòa
tan hoàn toàn thành dung dịch nhớt. Bể ổn nhiệt được chỉnh ở các nhiệt độ từ 15 °C đến 50 °C, mỗi phép đo cách nhau 5 °C. Trước mỗi phép đo, bể nhiệt được để ổn định với nhiệt độ được điều chỉnh ít nhất 5 phút trước khi tiến hành ngâm ống nghiệm. Ở mỗi nhiệt độ, ống nghiệm được đặt trong bể ủ nhiệt trong vòng 10 phút trước khi tiến hành khảo nghiệm, sau đó các ống nghiệm này được đưa về nhiệt độ 4 °C để kiểm tra khả năng phục hồi trạng thái dung dịch của mẫu. Nếu dung dịch trong ống nghiệm không chảy được khi đảo ngược ống, trạng thái được ghi nhận tạo gel. Nếu dung dịch trong ống nghiệm chảy khi đảo ngược, trạng thái của mẫu là dung dịch.
2.4.2. Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép Alg -F127
Sự chuyển pha của dung dịch Alg -F127 được nghiên cứu bằng phương pháp đảo ống nghiệm. Các Alg -F127 được điều chế với các tỷ lệ Pluronic F127 khác nhau từ 5, 10, 15 và 20 lần so với trọng lượng của Na-Alg-Cys. Theo đó các mẫu được đặt tên tương ứng như sau: Alg -F127 (5), Alg -F127 (10), Alg - F127 (15), Alg -F127 (20). Các mẫu dung dịch Alg-F127 đều cho kết quả chuyển pha phụ thuộc vào nhiệt độ và hàm lượng Pluronic có trong mẫu.
2.4.3. Khảo sát thời gian giảm cấp của các hydrogel copolymer ghép
Các hydrogel Alg -F127 và CS -F127 có nhiệt độ chuyển pha sol-gel nằm trong khoảng từ 30 °C đến dưới 37 °C là đối tượng được lựa chọn trong nghiên cứu này. Khả năng hấp thụ nước và giảm cấp cấu trúc của các hydrogel được đánh giá trong ba môi trường: PBS 1X (gibco, không chứa
Mg2+, Ca2+), PBS 1X + 1% collagenase (2mg/mL) và môi trường DMEM bổ
sung 10% FBS. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường 37 °C, đặt trong môi trường vô khuẩn. 0,5mL các gel ( mL) được lựa chọn cho vào ống nghiệm 5mL có nắp đậy và được để ổn định trong môi trường lạnh 2-8 °C trước khi sử dụng 1 ngày. Sau đó, các ống nghiệm được đặt trong tủ 37 °C trong 3 giờ để đảm bảo gel hình thành. Môi trường được ủ ấm trong bể ủ 37 °C trước sử dụng. Các ống nghiệm được cân trước khi cho 4,5mL môi trường
ngâm vào. Tại các thời điểm đã chọn, môi trường ngâm được loại bỏ và cân ghi nhận kết quả m2. Khả năng hấp thụ nước được tính như sau:
Hàm lượng nước hấp thụ = (� −�2 1)�100% (2.1) 1
�
Tốc độ phân rã của hydrogel được tính bằng công thức:
Tốc độ phân rã = ��−��
��−��
(2.2)
Trong đó mf là khối lượng tối thiểu còn lại trước khi bị phân rã hoàn toàn
thời gian tf là thời gian thu nhận được giá trị mf, mm là khối lượng tối đa của
hydrogel thu được và tm là thời điểm đạt khối lượng tối đa của hydrogel trong
môi trường ngâm.
2.5. ĐIỀU CHẾ, KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HỆ HYDROGELNHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC NHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC
2.5.1. Điều chế hệ hydrogel có mang các loại thuốc/hoạt chất sinh học
Trên cơ sở các công bố trước về tác động của các hoạt chất được nghiên cứu lên hiệu quả tăng sinh nguyên bào sợi cũng như tác động lên quá trình
chữa lành vết thương tiểu đường [66-68]. Hàm lượng 2 hoạt chất được nang
hóa trong 2 nền hydrogel như trong bảng 2.3. Trong nghiên cứu này các hệ CS - F127(15) và Alg -F127(10) tạo gel ở 20% được điều chế để mang các hoạt chất trên.
Bảng 2.3. Hàm lượng 2 hoạt chất được nang hóa trong 2 nền hydrogel
Hoạt chất Nồng độ trong hydrogel (µM/ppm)
Quercetin (QU) 20/6
Resveratrol (RE) 12/2,74
2.5.1.1. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU
Hòa tan hoàn toàn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4°C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ). Cho vào dung dịch trên 123µg QU hoạt chất. Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0°C. Đông khô mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 6ppm QU trong hệ gel 18% CS
2.5.1.2. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang RE
Hòa tan hoàn toàn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4 °C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ). Cho vào dung dịch trên 56,17 µg RE hoạt chất. Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0 °C. Đông khô mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 2,74 ppm RE trong hệ gel 18% CS -F127/ Alg -F127.
2.5.1.3. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU và RE
Hòa tan hoàn toàn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4°C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ). Cho vào dung dịch trên 123µg QU và 56,17 µg RE. Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0°C. Đông khô mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 2,74 ppm RE và 6ppm QU trong hệ gel 18% CS -F127/ Alg -F127
2.5.2. Xác định hàm lượng QU và RE được nang hóa trong hệ hydrogel
Hàm lượng RE và QU chứa trong hệ hydrogel CS -F127/ Alg -F127 được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại UV-Vis (Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer) với bước sóng hấp thu lớn nhất ở 324 nm (RE) và 374 nm (QU). RE tinh khiết được hòa tan trong DMSO : PBS (1:1) ở nồng độ 0 -12 ppm. QU tinh khiết được hòa tan trong ethanol : PBS (1:1) ở nồng độ 0 -5 ppm để dựng đường chuẩn. Mẫu được cho vào cuvet đặt trong máy Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer và tiến hành đo. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giữa nồng độ RE/QU và độ hấp thụ là phương trình đường thẳng dạng y = ax + b, trong đó y là độ hấp thụ còn x là nồng độ.
2.5.3. Kiểm tra tính nhạy nhiệt và xác định điểm chuyền pha của hệhydrogel CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE hydrogel CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE
Phương pháp inverted tube: Đối với phương pháp đảo ngược ống,
copolymer ghép mang các hoạt chất được hoà tan hoàn toàn trong các ống nghiệm chứa nước cất (12, 14, 16, 18 và 20 %w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt. Đánh giá khả năng nhạy nhiệt của dung dịch copolymer ghép mang hoạt chất bằng phương pháp khảo sát sự chuyển trạng thái sol-gel của dung dịch CS
trong nước lạnh dưới dưới 10 °C để đảm bảo sự hòa tan hoàn toàn thành dung dịch nhớt, các lọ chứa 1 g hydrogel được ủ trong bể nước gia nhiệt ở 15 °C trong 20 phút, để cho phép các mẫu cân bằng nhiệt với môi trường của chúng. Sau đó, nhiệt độ được tăng lên (2 °C/10 phút) từ 15 °C đến 60 °C. Mỗi lần tăng, các mẫu được lấy ra khỏi bể nước (tối đa 30 giây để ngăn chuyển pha do nhiệt độ bên ngoài) và được đảo ngược để quan sát hành vi của chất lỏng / gel. Các mẫu được phân thành ba loại: (1) chất lỏng khi mẫu di chuyển nhanh theo hướng trọng lực; (2) chất lỏng nhớt hoặc gel mềm khi mẫu di chuyển chậm xuống theo hướng trọng lực; (3) gel cứng khi mẫu vẫn ở dưới đáy lọ. Nhiệt độ tại đó mẫu được phân loại là gel cứng được gọi là điểm sol-gel
(Tgel ). Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần dưới sự quan sát
của một người.
2.5.4. Khảo sát và đánh giá khả năng nhả các hoạt chất ra khỏi hệhydrogel theo thời gian hydrogel theo thời gian
2.5.4.1. Khảo sát và đánh giá về khả năng nhả hoạt chất ra khỏihệ hydrogel hệ hydrogel
Khả năng phóng thích hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel được khảo sát dựa trên phương pháp khuyếch tán hoạt chất (RE/QU) trong hydrogel được chứa trong màng thẩm tách. Túi thẩm tách có khối lượng phân tử 3,5 kDa chứa 2 mL mẫu (hydrogel nồng độ 18%) được treo lơ lửng trong 20 mL dung dịch phosphate-buffered saline (PBS) có pH = 7,4 được đặt trong bể điều nhiệt và khuấy ở 37 ± 1 °C, tốc độ khuấy là 100 vòng/phút. Đối với RE/QU tự do được thực hiện như trên DMSO (RE); EtOH (QU) được sử dung để hòa tan hoạt chất với nồng độ 200ppm. Ở mỗi khoảng thời gian khác nhau (0h, 1h, 3h, 5h, 7h, 9h, 12h, 24h, 36h, 48h), 20 mL mẫu được rút ra, đồng thời thêm vào 20 mL dung dịch PBS để đảm bảo thể tích dung dịch đệm không đổi. Hàm