Alg-F127
Na-Alg-Cys
NPC-F127-OH
đã hoạt hóa giống với quy trình đã tổng hợp CS-F127. Cấu trúc hóa học của
hợp chất được xác định thông qua phổ FT-IR và 1H-NMR trong môi trường
nước. Trên phổ FT-IR của Alg-F127 các mũi dao động đặc trưng của Na-Alg, cys và F127 đều xuất hiện. Tần số hấp thụ của dao động NH và C=O trong liên kết amide được thể hiện rõ ràng hơn trong phổ ghép. Đặc biệt sự xuất
hiện tín hiệu hấp thụ mạnh của amide I và II ở số sóng 1600 đến 1700 cm-1.
Độ hấp thu của tín hiệu đặc trưng cho mannuronic acid dường như không có
sự thay đổi đáng kể, tuy nhiên các tín hiệu của guluronic acid tại 1294cm-1có
sự chuyển dịch sang vùng trên 1281cm-1. Mũi 1241 cm-1 cũng xuất hiện trên
phổ ghép những với độ sắc nét và rõ ràng hơn khi so sánh với phổ Na-Alg- Cys. (Hình 3.8).
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Tần số (cm-1)
Hình 3.8. Phổ FT-IR của Alg-F127 (1:10)
Sau khi ghép F127 lên, tín hiệu cộng hưởng của proton trên guluronate (H-1-G) và mannuronate (H-1-M) xuất hiện với cường độ rất thấp, do sự phản chắn mạnh nhất của hai nguyên tử oxi kề với chúng và sự phản chắn bởi
nguyên tử oxi từ liên kết trục (axial) là mạnh hơn từ liên kết xích đạo (equatorial) sau
khi được ghép với Pluronic F127. Chỉ còn tín hiệu của proton trên mannuronic acid, MH5, MH4 và MH3 xuất hiện trên phổ cộng hường từ tại
các vị trí 3,73ppm, 3,71ppm và 3,9 ppm như trong Hình 3.9 [90]
Hình 3.9. Phổ 1HNMR của Alg-F127
Ngoài các tín hiệu đặc trưng của Na-Alg-Cys, phổ còn cho thấy tín hiệu
ở trường mạnh δ =3,64 ppm tương ứng với proton của –CH2CH2– thuộc chuỗi
PEO của pluronic.
Dựa vào dữ liệu phổ FT-IR, 1H-NMR và so sánh với các tài liệu tham
khảo, chứng tỏ rằng đã tổng hợp thành công hệ copolymer ghép Alg-F127. 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER LÊN NHIỆT ĐỘ TẠO GEL
3.3.1. Kết quả khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS- F127 Bảng 3.1. Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng
chuyển đổi từ gel sang dung dịch và ngược lại.
F1 ( 1:1) 0,25 0,25g -- -- -- -- -- F2 (1:2) 0,25 0,5g -- -- -- - + F3 (1:3) 0,25 0,75g -- -- -- + + F4 (1:4) 0,25 1g -- -- -- + + F5 (1:5) 0,25 1,25g -- -- + ++ + F6 (1:10) 0,25 2,5g -- -- ++ ++ ++ F7 (1:15) 0,25 3,75g -- -- +++ +++ +++ F8 (1:20) 0,25 5g -- + +++ +++ +++
(---: không có khả năng tạo gel; +: tạo gel yếu; ++: tạo gel khá tuy nhiên gel chưa đặc lại hoàn toàn; +++: tạo gel tốt, gel đông đặc không chảy khi đặt nghiêng)
Hình 3.10. Chuyển hóa sol-gel của các dung dịch CS-F127 ở 10 °C va 37 °C Đặc tính nhạy nhiệt của dung dịch copolymer ghép CS-F127 được
nghiên
cứu bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm và kết quả được thu nhận vào bảng 3.1. Tất cả các mẫu được đặt trong bể nhiệt có nhiệt độ từ 4 °C đến 90 °C khoảng 1 phút, sau đó quan sát khả năng chảy của dung dịch trong ống để xác định trạng thái của vật liệu. Như kết quả trình bày trong bảng 3.1, mẫu F1
không cho thấy có sự thay đổi trạng thái trong khoảng nhiệt độ thử nghiệm. Khi nồng
độ Pluronic tăng lên 200 % so với trọng lượng chitosan (mẫu F2), khi ống mẫu đặt trong bể nhiệt 30-50 °C, độ nhớt của dung dịch tăng làm cản trở quá trình chảy. Hàm lượng pluronic F127 càng tăng, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ chảy của dung dịch mẫu càng giảm. Tuy nhiên, từ mẫu F2 đến F6 khả năng tạo gel vẫn chưa đáp ứng yêu cầu tạo thành màng gel rắn không chảy khi đặt nghiêng (Hình 3.10).
Mẫu F7 và F8 có gel hình thành tốt ở nhiệt độ của cơ thể con người (30- 40 °C), tuy nhiên mẫu F8 với tỷ lệ chitosan/ pluronic là 1:20 cho thấy gel có thể hình thành ở nhiệt độ 25 °C. Như vậy, nhiệt độ tạo gel càng thấp khi tăng hàm lượng pluronic F127. Bên cạnh đó, khi giảm nhiệt độ, mẫu gel này cho thấy sự thoái biến bởi nhiệt. Đặc tính đảo ngược trạng thái sol-gel theo nhiệt độ môi trường của gel này cho thấy tiềm năng trong việc nghiên cứu tạo lớp màng polymer sinh học. Kết quả khảo sát chuyển trạng thái sol-gel theo nồng độ và nhiệt độ (Hình 3.11) cho thấy mẫu F7 có thể tạo gel ở nồng độ copolymer khá thấp (trên 10 % wt/v) tại khoảng nhiệt độ 32-37 °C. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi thay môi trường nước bằng đệm PBS hay môi trường nuôi cấy tế bào DMEM cũng không ảnh hưởng đáng kể đến nhiệt độ chuyển pha của 2 hệ dung dịch polymer F7 và F8. Cả 2 hệ polymer trên đều có điểm tan gel ở trên 50 °C nên rất thích hợp cho các mục đích ứng dụng
trong y sinh học.
Hình 3.11. Đồ thị thể hiện sự tương quan của nồng độ copolymer (%wt/v) và nhiệt độ lên quá trình chuyển pha sol-gel
So sánh giữa mẫu F7 và F8 không có sự khác biệt, trong khi đó càng tăng tỷ lệ ghép, lượng chitosan giảm, lượng F127 tăng, cơ lý của vật liệu bị ảnh hưởng, khả năng kháng khuẩn từ chitosan giảm và thời gian giảm cấp nhanh. Từ kết quả thu được chúng tôi lựa chọn mẫu F7 = CS-F127 (1 :15) làm các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Kết quả khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép Alg- F127 Sự chuyển pha của dung dịch Alg-F127 được nghiên cứu bằng phương pháp đảo ống nghiệm. Các Alg-F127 được điều chế với các tỷ lệ pluronic F127 khác nhau từ 5, 7, 10, 15 và 20 lần so với trọng lượng của Na-Alg-Cys. Theo đó các mẫu được đặt tên tương ứng như sau: Alg-F127 (5), Alg-F127 (7), Alg- F127 (10), Alg-F127 (15), Alg-F127 (20). Các mẫu dung dịch Alg-F127 đều cho kết quả chuyển pha phụ thuộc vào nhiệt độ và hàm lượng Pluronic có trong mẫu. Theo sơ đồ chuyển pha (Hình 3.12) cho thấy sự chuyển pha phụ thuộc vào nồng độ và nhiệt độ, khi tăng nồng độ polymer, quá trình tạo gel diễn ra ở nhiệt độ thấp hơn. Đối với các mẫu Alg-F127 có nồng độ thấp hơn 8 %wt/wt thì chỉ hiện tượng tăng độ nhớt dẫn đến quá trình chảy của dung dịch trong ống bị cản trở khi tăng nhiệt độ, và dòng chảy dung dịch polymer trở lại bình thường khi nhiệt độ giảm về dưới 10 °C, tuy nhiên không có hiện tượng tạo thành khối đặc được ghi nhận trong tất cả khoảng nhiệt độ khảo sát. Điều đó có thể là do sự liên kết của vùng kỵ nước PPO trong các chuỗi Alg-F127 chưa đủ để tạo được mạng lưới không gian 3 chiều liên tục để giữ được nước trong vùng không gian ưa mước. Khi tăng nồng độ lên wt/wt 8%, trạng thái ngừng chảy của dung dịch trong ống nghiệm xảy ra. Hiện tượng này cũng được quan sát thấy ở các mẫu Alg-F127 (10), Alg-F127 (15) và Alg-F127 (20). Các mẫu gel hình thành trở nên cứng hơn khi nhiệt độ thử nghiệm tăng dần trong khoảng 40-50 °C. Ở những mẫu có hàm lượng Pluronic F127 thấp
hơn như Alg-F127 (5), sự tạo thành gel xảy ra khi nồng độ của mẫu tối thiểu ở 13 wt/wt% và diễn ra ở nhiệt
độ trên 35°C. Đặc biệt, cùng hàm lượng Pluronic F127, mẫu CS-F127 (F5, CS: F127= 1:5 theo khối lượng) không cho thấy sự thành thành gel ngoài sự gia tăng của độ nhớt. Được lý giải do khả năng giữ nước của Na-Alg cao hơn so với chitosan nên tăng cường quá trình hydrat hóa trên chuỗi Na-Alg và đồng thời dẫn đến tăng cường tương tác của các chuỗi kỵ nước có trên mạch Pluronic dẫn đền tăng cường mật độ các mặt xích trong mạng lưới 3D để có thể xảy ra hiện tượng tạo gel. Điều này còn được thể hiện ở các mẫu Alg- F127 có hàm lượng Pluronic cao như Alg-F127 (15) và Alg-F127 (20), cho thấy có hiện tượng tạo gel ở nhiệt độ 20 °C ở nồng độ 20 wt%, trong khi cùng nồng độ mẫu F7 và F10 hiện tượng ngừng chảy của dung dịch trong ống nghiệm chỉ xảy ra khi nhiệt độ trên 25 °C.
(A) (B)
Hình 3.12. (A) Hình ảnh chụp các tiêu chí đánh giá về sự hình thành gel: (i) không có khả năng tạo gel, (ii) gel yếu, vẫn chảy trong ống nghiệm nhưng tốc độ rất châm, (iii) tạo gel khá, không chảy trong ống nghiệm khi đảo ngược, tuy nhiên vẫn chảy khi có tác động cơ học như lắc mạnh, (iv) tạo gel tốt, gel đông đặc không chảy khi có tác động của cơ học. Từ khảo sát về sự hình thành gel của các copolymer Alg-F127 ở các nồng độ khác nhau ở các điểm nhiệt độ từ 10 °C đến 50 °C, giản đồ (B) thể hiện mối tương quan giữa nồng độ Alg- F127 và nhiệt độ trong sự tạo gel trong môi trường nước.
Đặc biệt, các mẫu CS-F127 gel tạo thành là dạng gel trong suốt không khác biệt khi so sánh với gel F127 và không biến đổi ở 20 wt/wt%. Trong khi mẫu Alg-F127 tạo thành gel đục hoặc dung dịch chuyển thành đục khi nhiệt độ tăng lên, và độ đục biến mất khi nhiệt độ được đưa về dưới 10 °C. Đặc tính này thể hiện rõ ràng ở các mẫu có hàm lượng Na-Alg-Cys cao như Alg-F127 (5), Alg-F127 (7), riêng mẫu Alg-F127 (20) tạo thành gel có độ trong suốt cao nhất so với các Alg-F127 khác. Điều này chứng tỏ Na-Alg-Cys tham gia làm tăng mức độ tách pha của các Alg-F127 trong môi trường nước. Ở những mẫu có sự tham gia của Na-Alg-Cys cao, vùng tương tác kỵ nước do pluronic tạo ra không đủ để giữ mạng lưới do Na-Alg-Cys. Hiện tượng gel đục không được ghi nhận ở các trường hợp của CS-F127 hydrogel như trong môi trường nước cất. Tuy nhiên, với mẫu F7 khi pha trong dung dịch PBS 7,4, các mẫu cho thấy sự hình thành gel đục thay vì gel trong suốt như khi pha trong môi trường nước cất. Hiện tượng này hoàn toàn phụ hợp với đặc tính nhạy pH của chitosan, sự kết tủa được hình thành nếu dung dịch chitosan có pH trên 7,0. Do sự chuyển đổi một phần tính chất từ ưa nước sang kỵ nước khi ở môi trường kiềm dẫn đến sự tăng lên của quá trình tách pha, do đó các gel tạo thành bởi mẫu F7 trong môi trường PBS có độ truyền qua kém hơn so với mẫu pha trong môi trường nước.
Bên cạnh đó, khoảng nhiệt độ cho sự hình thành gel trong 3 môi trường nước cất, PBS 1X (7,4) và DMEM có nồng độ glucose cao được khảo sát với các mẫu Alg-F127(10), Alg-F127 (15) và mẫu Alg-F127 (20) được pha ở 3 nồng độ 10wt%, 15wt% và 20wt%. Khoảng nhiệt độ tạo gel được xác định từ
nhiệt độ tối thiếu tạo thành gel (Tg, tương đương với +++) đến nhiệt độ gel bắt
đầu bị chảy (Tm). Để khảo sát chính xác, trong thí nghiệm này, nhiệt độ của bể
ổn nhiệt được nâng với tốc độ 2 °C /lần và sử dụng nhiệt kế để xác định chính xác nhiệt độ ở trong bể. Dựa trên kết quả ở khảo sát tổng quan về các Alg- F127 gel và CS-F127 gel, nhiệt độ khảo sát được bắt đầu từ 10 °C.
Hình 3.13. Đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ copolymer và nhiệt độ chuyển sol-gel
Kết quả thu được từ quá trình khảo sát điểm tạo gel và tan gel theo nhiệt độ như trong hình 3.13 cho thấy giá trị Tgel và Tm của Alg-F127 có sự phụ thuộc
vào môi trường dùng để pha polymer. Cụ thể, Tgel của tất cả các mẫu Alg- F127 ở các nồng độ khi pha trong nước cất đều cao hơn so với các mẫu Alg- F127 được pha trong môi trường PBS và DMEM. Khoảng nhiệt độ tạo gel của Alg- F127 trong môi trường PBS và DMEM hầu hết đều rộng hơn khi so sánh với các mẫu gel Alg-F127 cùng nồng độ khi pha trong môi trường nước
cất. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với đặc tính của Na-Alg-Cys [90, 91]
Trong môi trường DMEM và PBS 7,4 đều chứa muối hoặc các thành phần điện giải, dẫn đến hiện tượng tủa muối của Na-Alg-Cys dẫn đến quá trình tủa của của chuỗi polymer của Na-Alg-Cys làm cho quá trình hình thành gel ở các mẫu này xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn so với các mẫu gel pha bằng nước cất. Bên cạnh đó, nhờ sự tham gia của các ion này vào mạng lưới làm cho khả năng đan lưới của Na-Alg-Cys cao hơn, do đó mạng lưới hình thành sẽ trở nên cứng hơn, dẫn đến nhiệt độ chảy của các hệ gel này đều cao hơn so với các gel Alg- F127 trong nước cùng nồng độ. Cả 3 hệ polymer trên đều có tạo gel ở 30-35 °C và điểm tan gel ở trên 50 °C nên rất thích hợp cho các mục đích ứng dụng trong y sinh học.
3.3.3. Kết quả khảo sát thời gian giảm cấp của các hydrogel copolymer ghép
3.3.3.1. Kết quả đánh giá khả năng hấp thụ nước của hydrogel
Sự hấp thu nước, một trong những tính chất quan trọng nhất của hydrogel sinh học, phản ánh khả năng giữ nước và khuếch tán nước của hydrogel, có liên quan đến khả năng hấp thụ chất lỏng của cơ thể và chuyển hóa các chất dinh dưỡng. Trong lĩnh vực tái tạo mô vết thương, khả năng hấp thu dịch tiết từ vết thương, khả năng duy trì được môi trường ẩm của vết thương, trái ngược với kỹ thuật dùng gạc "kinh điển”. Dùng gạc có thể tạo ra một lớp dính chắc và khô, chống lại "môi trường ẩm cần thiết cho vết
thương", hạn chế ngay cả các enzym có tác dụng dọn sạch hoại tử cần thiết cho quá trình lành vết thương.
Với tính chất hấp thụ nước mạnh của Alg, nên các mẫu Alg-F127 được khảo sát hết để tìm mẫu giữ nước tốt nhất trong khi đó mẫu CS-F127 (1:15) được cố định từ các kết luận kết quả trước của chúng tôi ( F7 là mẫu tốt nhất trong các mẫu CS-F127 khảo sát tạo gel)
Dữ liệu đánh giá khả năng hấp thụ nước của các Alg-F127 và CS-F127 hydrogel được trình bày trong hình 3.14, hình 3.15 và hình 3.16. Xét về mặt tổng quan, mẫu hydrogel Alg-F127 thể hiện khả năng hấp thụ nước cao hơn hẳn các mẫu hydrogel được điều chế từ chitosan khi ngâm trong cả ba môi trường. Cụ thể, ở ngày đầu tiên ngâm, khối lượng CS-F127 20% hydrogel tăng lên 252,67±6,67%, tương ứng với 152,67±8,23% lượng nước được hấp thụ (trong dung dịch PBS), 253,26±1,5% với hàm lượng nước là 153,26±6,67% (trong PBS+collagenate enzyme) và 253,77±2,52% với hàm lượng nước là 153,67±2,57% (trong DMEM có bổ sung FBS 10%). Trong khi mẫu Alg-F127 nồng độ 15% (mẫu hấp thu nước cao nhất trong các mẫu hydrogel Alg-F127) khối lượng tăng lên cao hơn tương ứng trong các môi trường ngâm mẫu CS- F127 20% khoảng 1,11 lần đối với PBS 1X (280,67±1,53%, nước chiếm 180,67±3,06%), 1,13 lần đối với PBS+collagenase (284,67±6,81%, nước chiếm 184,7±13,61% ) và 1,11 lần đối với DMEM (280,67±8,02% nước chiếm 180,7±16,04%). Sự khác biệt giữa hai loại hydrogel có thể giải thích do sự khác biệt về nhóm chức năng
trên bề mặt hydrogel. Giá trị pKa của chitosan là 6,5 [92], trong khi giá trị
pKa của mannuronic (M) và guluronic (G) acid, thành phần trên chuỗi
alginate lần lượt là 3,38 và 3,65 [93]. Trong môi trường pH 7,4, sự ion hóa
nhóm chức trên bề mặt chitosan bị giảm đi trong khi hầu hết các nhóm carboxylate trên alginate chuyển về trạng thái ion dẫn đến thúc đẩy quá trình solvat hóa mạnh và làm tăng khả năng hấp thụ nước của Alg-F127 hydrogel.
Hình 3.14. Hàm lượng nước (%) được hydrogel hấp thụ khi ngâm trong dung dịch PBS 1X (pH 7,4) trong thời gian 12 ngày (n=3).
Bên cạnh đó, hydrogel từ cơ sở chitosan cho thấy không có khả năng giữ nước trong mạng lưới cấu trúc. Trọng lượng ướt của CS-F127 hydrogel tăng tối đa trong ba môi trường ngâm ở ngày thứ 2 tuy nhiên không có sự khác biệt ở ý nghĩa 5% so với ngày đầu tiên, sau đó khối lượng giảm dần ở