Phƣơng pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra kết quả, do đó ngƣời ta đã phát triển nhiều phƣơng pháp thử nhanh để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực pham và mẫu nƣớc trong thời gian ngắn, từ có biện pháp xử lý kịp thời đối với các mẫu nhiễm. Xu hƣớng ngày càng sử dụng nhiều PCR và IMS. Phƣơng pháp PCR giúp phát hiện nhanh, tuy nhiên dễ xảy ra hiện tƣợng âm tính giả,đòi hỏi các thao tác thành thạo. Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lƣợng mẫu và chi phí nhƣng lại có độ nhạy kém hơn. Ngƣời ta đã phát triển thêm phƣơng pháp Real Time PCR từ PCR truyền thống. Phƣơng pháp này có độ nhạy rất cao, cho kết quả sớm hơn, không cần chạy điện di sau phản ứng khuyếch đại. Phƣơng pháp miễn dịch từ phân tách là một lựa
chọn tốt hơn. Nó có độ nhạy cao (<104 CPU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm đƣợc thực hiện trong 4-5 giờ).
Bên cạch những kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phƣơng pháp khác nhƣ: Phƣơng pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm ngƣời ta kết hợp nhiều phƣơng pháp khác nhau, ví dụ nhƣ IMS – PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực pham.
1.2.2.1. Phương pháp PC
Nguyên tắc: Phƣơng pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có đƣợc khuyếch đại hay không. Quá trình xác định đƣợc thực hiện bằng cách điện di sản pham khuyếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bƣớc sóng là 302 nm.[ Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996)]
-Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản pham khuyếch đại có kích thƣớc phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định.
-Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel điện di không xuất hiện sản pham khuyếch đại hay sản pham khuyếch đại có kích thƣớc không phù hợp với đoạn ADN đích.
Thiết bị, dụng cụ:
- Máy luân nhiệt
- Máy ly tâm
- Máy lắc ống nghiệm
-Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đến 150 Volt
- Hộp đèn soi UV có kính lọc 302 nm
- Bộ chụp ảnh trên đèn UV
- ng Eppendorf 0,2 ml; 0,5ml; 1,5ml chuyên dùng cho PCR
-Mồi gồm 2 mồi invA1 và invA2 đƣợc thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và ngƣời. Trình tự của hai mồi nhƣ sau:
+) invA1: 5’ – TTGTTACGGCTATTTTGACCA – 3’ +) invA2: 5’ – CTGACTGCTACCTTGGCTCTGATG – 3’
Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích đƣợc pha loãng thành 6pM trong đệm TE. Đệm TE có thành phần nhƣ sau: 10mM Tris – HCl (pH = 8), 1mM EDTA. [Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996)]
Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật và các loại hóa chất khác:
Khuyến khích sử dụng môi trƣờng nuôi cấy dạnh bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuyếch đại PCR đƣợc tổng hợp thành kit đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng có thành phần phù hợp nhƣ: Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Trong trƣờng hợp sử dụng các vật liệu, hóa chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nƣớc pha chế phải đảm bảo chất lƣợng dùng cho vi sinh và sinh học phân tử.
Thang ADN:
Nên sử dụng thang đo phủ hợp, có thể ƣớc lƣợng đƣợc đoạn khuyếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản pham khuyếch đại có kích thƣớc 520bp đã biết trƣớc làm thang đo trong phƣơng pháp này.
Agarose:
Sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thƣớc nhỏ hơn 1000bp
Phƣơng pháp tiến hành:
Lấy mẫu: Cân chính xác 25g mẫu ( hoặc một khối lƣợng chính xác tùy theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng.
Tăng sinh: Nhằm làm tăng số lƣợng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thƣơng cũng đƣợc phục hồi và phát triển. Giai đoạn này đƣợc tiến hành trong môi trƣờng không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lƣợng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lƣợng môi trƣờng tăng sinh. Nếu lấy 25g
mẫu, phải bổ sung 225g môi trƣờng tăng sinh dung dịch pepton đệm. Ủ mẫu có môi trƣờng tăng sinh ở nhiệt độ 37 trong khoảng 18 giờ 2 giờ.
Xử lý mẫu giải phóng ADN: Giai đoạn này nhăm thu nhận sinh khối sau khi
tăng sinh, rửa sạch môi trƣờng sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng DNA. Cách xử lý nhƣ sau:
-Lắc đều canh khuan tăng sinh. Hút 0,5ml vào ống eppendorf có thể tích 1,5ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ môi trƣờng lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dƣới với nƣớc cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ nhƣ trên để loại bỏ phần nƣớc.
-Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5ml nƣớc cất vô trùng. Đun sôi cách thủy trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên đƣợc coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuyếch đại.
- Khuyếch đại:
+) Giai đoạn này nhằm làm tăng số lƣợng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt bằng hai mồi đặc trƣng. Quá trình khuyếch đại đƣợc tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.
+) Chuan bị ống khuyếch đại:
• Hút 45ml hỗn hợp khuyếch đại PCR 1,1x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể
tích 0,2ml hoặc 0,5 ml, thêm vào 1ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6pM và 3ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuyếch đại là 50ml.
• Đối chứng dƣơng: Thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella
chuan đã biết.
• Đối chứng âm: Thay dịch khuôn ADN bằng nƣớc cất vô trùng
+) Chƣơng trình khuyếch đại: Các ống khuyếch đại đƣợc đặt vào trong máy luân nhiệt. Chƣơng trình khuyếch đại nhƣ sau: Duy trì nhiệt độ 950C trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi DNA trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bƣớc nhƣ sau: 95 /60 giây, 54 / 45 giây, 72 /60 giây.
Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu đƣợc giữ ở nhiệt độ 72 độ trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20 cho đến khi điện di.
- Điện di sản pham khuyếch đại:
+) Chuan bị gel agarose 1%: Gel agarose 1% pha trong đệm TE 1x đƣợc đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có s n các lƣợc để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày 3 – 4 mm. Gel sau khi chuan bị đƣợc ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.
+) Chuan bị dịch điện di: Mẫu sau khi khuyếch đại đƣợc nhuộm với 10ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.
+) Điện di: Một giếng trong gel điện di đƣợc sử dụng cho thang ADN chuan hay mẫu đối chứng dƣơng. Nạp 10ml dịch điệm di đã chuan bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 V.
Nhuộm DNA, quan sát sản pham khuyếch đại:
-Chuan bị dung dịch nhuộm mẫu: Pha dung dịch nhuộm DNA nhƣ sau: Cho 0,2
etyl bromua 10mg/ml vào 500ml nƣớc, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.
-Nhuộm gel: Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nƣớc trong khoảng 3-5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dƣ.
-Quan sát, chụp hình: Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của DNA xuất hiện trên bản gel. Sau đó chụp hình để lƣu giữ kết quả.
Đọc và giải thích kết quả:
-Kết quả phân tích chỉ đƣợc xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dƣơng tính có sản pham khuyếch đại ADN với kích thƣớc 520 bp và mẫu đối chứng âm tính không có sản pham này.
-Mẫu đƣợc kết luận là dƣơng tính Salmonella khi có sản pham khuyếch đại 520 bp trên bản gel.
-Mẫu đƣợc kết luận là âm tính khi không có sản pham khuyếch đại hoặc có sản
1.2.2.2. Phương pháp
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng dƣới dạng các kit thƣơng mại và có thể cải tiến để tự động hóa. Elisa có thể sử dụng để phát hiện và định lƣợng vi sinh thực pham trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy khoảng 106 CPU/ml, tuy nhiên vẫn phải thực hiện bƣớc tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trƣớc khi thực hiện các phản ứng miễn dịch.
Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) là 1 bộ kit phát hiện nhanh
Salmonella spp, dựa trên nguyên tắc E sanwich. Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lọc
đƣợc cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm mao của vi sinh vật tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự do gắn enzyme peroxydase tạo thánh 1 phức hợp kép (sanwhich). Sau đó các kháng thể có gắn enzyme ở dạng tự do không tạo phức hợp kép sẽ bị rửa trôi khỏi phản ứng. Phức hợp sanwhich sẽ đƣợc phát hiện nhờ sự bổ sung cơ chất của phản ứng (ure peroxydase và teramethylbenzidine). Enzyme peroxide sẽ thủy phân cơ chất tạo phản ứng màu xanh dƣơng. Phản ứng kết thúc bắng cách bất hoạt enzyme bằng dung dịch acid hóa môi trƣờng và làm môi trƣờng chuyển từ màu xanh sang màu vàng. Sự hình thành màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên hay vi sinh vật mục tiêu và mật độ màu của vi sinh vật có thể xác định bằng cách đo cƣờng độ màu bằng máy so màu. [Wu, S.X, Tang, Y. (1993)]
1.3. Các iện pháp iể oát Salmonella trong thực phẩ
Đối với gia súc và gia cầm: Trong chăn nuôi cần chú ý đề phòng bệnh tật cho chúng. Phải kiểm tra thú y khi giết súc vật, điều này càng làm tốt thì càng có ít cơ hội bán và xuất ra các loại thịt đã nhiễm Samonella. Trong khi giết thịt phải đảm bảo tính riêng rẽ, tránh sự lây lan của vi khuan, chú ý tới các dụng cụ dùng khi giết thịt.
Trong bảo quản thực pham, đảm bảo thời gian cất giữ thực pham đã chế biến. Chú ý thịt băm, pate.. thịt nghiền mà không ƣớp lạnh ngay sau đó sẽ tạo điều kiện cho toàn bộ khối nguyên liệu đó nhiễm trùng nhanh chóng.
Đun sôi thực pham là biện pháp tốt nhất. Thịt đã ƣớp lạnh thì thời gian đun nấu phải kéo dài hơn bình thƣờng, khi đun sôi phải đảm bảo nhiệt độ sôi cả bên trong miếng thịt ít nhất 5 phút. Thực pham còn thừa, thực pham dự trữ phải đƣợc đun lại trƣớc khi ăn. Với trứng có thể bị nhiễm Salmonella rất sớm ngay
từ khi mới đẻ vì vậy phải chế biến hoàn toàn, tuyệt đối không ăn sống hoặc hồng đào. Đảm bảo vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng và chuột.[ FAO and WHO (2009)]
Thực hiện nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trƣớc khi vào và khám định kỳ (1 năm/ 1 lần) đối với ngƣời tiếp xúc trực tiếp với thực pham nhất là thực pham đã nấu chín.
CHƢƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuan đƣờng ruột
Salmonella S1 nhằm cung cấp những thông tin và cơ sở khoa học cần thiết cho
các phát hiện, chuan đoán có liên quan.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu về một số đặc điểm sinh học của vi khuan Salmonella S1.
- Hoạt hóa và nhân giống chủng vi khuan Salmonella S1 và nhuộm Gram
- Xác định hoạt tính của chủng Salmonella S1:
+ Lên men đƣờng glucose, lactose và sinh H2S
+ Thử nghiệm khả năng phân giải Urea
+ Thử nghiệm phân giải đƣờng Manitol
+ Lên men đƣờng saccharose
+ Khả năng đề kháng kháng sinh
2.3. Địa điểm và thời gian nghiêm cứu
-Thời gian: Từ ngày 15/1/2018 đến ngày 2/5/2018
- Địa điểm: Bộ môn công nghệ Vi sinh - Hóa sinh – Viện Công Nghệ Sinh
học, trƣờng Đại Học Lâm nghiệp Việt Nam.
2.4. Đối tƣợng nghiên cứu
Chủng vi khuan đƣờng ruột Salmonella S1 do bộ môn Vi sinh - Hóa sinh thuộc
Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp cung cấp.
2.5. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.5.1. Vật liệu
Bảng 2.1 : Hóa chất dùng trong nghiên cứu
Nƣớc cất Manitol
Peptone D – Manitol.
Cao nấm men FeSO4
Agar Sodium thiosulfate
NaCl Phenol Red
Lactose K2HPO4 Glucose KH2PO4 Saccharose Urea 2.5.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị : Bảng 2.2: Các thiết bị máy móc
Cân điện Máy đo pH
Lò vi sóng Tủ lạnh
Tủ ấm 37 Máy ly tâm
Tủ sấy Máy nuôi lắc
Nồi hấp khử trùng 121 Tủ hút hóa chất
Box cấy vô trùng Máy lắc Vortex
Dụng cụ:
Bảng 2.3: Các dụng cụ trong nghiên cứu
Đĩa petri Que cấy thẳng, que cấy vòng
Ong nghiệm Ong nghiệm khử trùng
Bình tam giác Đèn cồn
Chai chịu nhiệt dung tích 200ml,
500ml Bóp cao su
Kéo cắt mẫu Giá ống nghiệm inox
Pipet 1ml, 5ml, 10ml Bông không thấm
Micropipet 10μl - 200μl Que trải
Túi PE vô trùng Cồn 70° , 90°
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.1. Phƣơng pháp hoạt hóa và nhân giống chủng vi khuẩn Salmonella S1
Chủng Salmonella S1 đƣợc cung cấp bởi bộ môn Vi Sinh – Hóa Sinh viện
Công Nghệ Sinh học Lâm nghiệp. Phƣơng pháp:
- Chuan bị môi trƣờng LB (Lysogeny Broth) gồm có:
+ Pepton: 10g/lít
+ Cao nấm men: 5g/lít
+ NaCl: 5g/lít
+ Agar: 18 – 20g/lít
Sau khi chuan bị xong môi trƣờng LB môi trƣờng nuôi cấy vi khuan thông thƣờng, đầu côn đã hấp khử trùng. Tiến hành trải dịch VK lên môi trƣờng LB:
+ Từ ống đông khô hút 100 dịch VK Salmonella S1 trải lên môi trƣờng LB đặc.
+ Trải: Dùng que trải đều trên đĩa môi trƣờng đến khi khô lại đậy nắp, bọc màng bọc thực pham và nuôi trong 18 - 24 giờ ở 37 .
- Sau khi VK đã phát triển trên đĩa thạch 24 giờ tiến hành cấy ria để tạo khuan lạc riêng rẽ:
+ Tiến hành cấy ria để tinh sạch chủng vi khuan Salmonella. Các kỹ thuật cấy ria nhƣ: kiểu chữ chi; chữ T; ria 3 góc;…vết cấy cạn dần cho đến khi xuất hiện các khuan lạc riêng rẽ, thuần khiết.
2.6.2. Phƣơng pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một phƣơng pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuan thành 2 nhóm (Gram dƣơng và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuan Gram dƣơng sẽ giữ đƣợc phức hợp tím gentians-iod không bị tay màu bởi alcohol, trong khi vi khuan Gram âm không giữ đƣợc phức hợp này.
Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuan Gram dƣơng vẫn giữ đƣợc màu tím của gentians, còn vi khuan Gram âm bắt màu hồng của fucshin.
Tiến hành:
- Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm: Nhỏ một giọt nƣớc cất lên tấm lam kính sạch, sau
đó lấy 1/3 khuan lạc dàn đều tan hoàn toàn trong giọt nƣớc.
- Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn: Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách
hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuan sẽ biến dạng.
- Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuộm mẫu trong 1 phút.
- Rửa nƣớc tối đa 5 giây.
- Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút. - Rửa bằng rƣợu trong 10 giây.
- Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần
cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút).
- Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất. - Rửa qua nƣớc, để khô.
- Soi dƣới kính hiển vi vật kính 100x có giọt dầu.