2.6.3.1. Phân giải đường glucose, lactose và sinh H2S
Thử nghiệm sinh H2S trên môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar): Môi trƣờng KIA
đƣợc sử dụng thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau nhƣ glucose, lactose và khả năng sinh H2S. Dựa vào lên men glucose, lactose, sinh hơi và khử lƣu huỳnh để phân biệt các thành viên lên men và không lên men trong họ Enterobacteriaceae. Nhóm không lên men lactose thƣờng có khuynh hƣớng gây bệnh đƣờng ruột.
Về nguồn carbon, môi trƣờng KIA chứa hai loại đƣờng là 1% Lactose và 0,1%
glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trƣờng này có ba trƣờng hợp xảy ra đối với sự tăng trƣởng của VSV:
- Thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH của môi trƣờng, chỉ thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng và thạch nuôi cấy cũng chuyển từ đỏ sang vàng.
- Thứ hai: Sử dụng lactose và biến dƣỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trƣờng tăng chỉ thị Phenol Red chuyển từ vàng sang đỏ. Môi trƣờng chia 2 phần đỏ/ vàng sau 18 – 24 giờ nuôi cấy.
- Thứ ba: Không sử dụng cả hai đƣờng này. Acid amin là nguồn dinh dƣỡng duy
nhất, tạo NH3, giữ nguyên pH môi trƣờng, chỉ thị phenol red không đổi màu, thạch vẫn giữ nguyên màu đỏ trong suốtquá trình nuôi cấy.
- Nếu vi sinh vật có khả năng khử lƣu huỳnh thành H2S thì sẽ tạo kết tủa đen. Các vi sinh vật này thƣờng thuộc nhóm lên men glucose, không lên men lactose (đỏ/vàng).
- Salmonella chỉ lên men đƣợc đƣờng glucose nên phần nghiêng của môi trƣờng
có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.
Về sinh hơi: Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất
hiện các vệt màu đen trong môi trƣờng này. Ngoài ra có thể thấy rõ hiện tƣợng sinh hơi qua hiện tƣợng làm vỡ thạch hoặc môi trƣờng bị đay lên trên tạo một khoảng trống bên dƣới đáy ống nghiệm.
Tiến hành:
Chuan bị môi trƣờng KIA có pH = 6,8 0,2
Sau khi pha xong môi trƣờng đem chuan độ pH từ 6,8 ± 0,2
Bảng 2.4: Công thức môi trƣờng KIA
Hóa chất Khối lƣợng
Pepton 20 g
Lactose 20 g
Glucose 1 g
NaCl 5 g
Feric ammonium citrate(FeSO4) 0,5 g
Sodium thiosulfate 0,5 g
Agar 15 g
Phenol Red 0,0,25 g
Sau khi pha và chuan độ xong pH đem hấp khử trùng ở 121
- Sau khi hấp khử trùng xong đổ môi trƣờng vào các ống nghiệm mỗi ống
ngiệm 3ml để nghiêng và chờ cho các ống nguội.
- Khi môi trƣờng đã nguội dùng que cấy nhúng cồn hơ nóng đỏ để nguội
: Lấy một lƣợng sinh khối lớn khuan lạc đƣợc chọn cấy thấu xuống đáy của nghiệm và ria trên bề mặt nghiêng.
- Sau khi cấy VSV xong nuôi ở 37 ủ từ 18 – 24 giờ có thể ủ đến 48 giờ để theo dõi kết quả.
2.6.3.2. Thử nghiệm khả năng phân giải Urea
Thử nghiệm khả năng phân giải urea: Đƣợc thực hiện trên môi trƣờng urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Borth), chứa chỉ thị phenol red, chuyển từ màu vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu là pH 6.8 – 8,4).
Nguyên tắc: Sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt Urea thành ammonia hóa
do hoạt tính của urea từ vi sinh vật và kết quả là môi trƣờng bị kiềm hóa pH tăng lên do NH3 đƣợc tạo ra.
Tiến hành:
Chuan bị môi trƣờng RSU(Rustigian – Stuart – Urea Borth) Có pH = 6,8 ± 0,2
Bảng 2.5: Công thức môi trƣờng RSU
Hóa chất Khối lƣợng Uera 20 g Cao nấm men 0,1 g K2HPO4 9,5 g KH2PO4 9,1 g Phenol Red 0,01 g Nƣớc cất 1 lít
-Hấp khử trùng môi trƣờng và đầu côn 20 - 100𝜇 𝜇 ở 121 trong 20 phút, sau đó lấy ra để nguội
-Tiến hành hút 100𝜇𝜇 dịch Salmonella nuôi lỏng lắc đều cho vào 30ml môi trƣờng RSU đã nguội lắc đều và nuôi ở 37 trong 48 giờ.
- Môi trƣờng có màu hồng nhạt
2.6.3.3. Thử nghiệm phân giải đường Manitol
Thử nghiệm lên men đƣờng đƣợc thực hiện trên môi trƣờng lỏng chứa đƣờng
Manitol và chỉ thị Phenol Red.
Nguyên tắc: Môi trƣờng có chứa chỉ thị Phenol Red dùng để nhận biết sự phân
giải đƣờng Manitol. Nếu VSV lên men phân giải đƣờng thì sẽ tạo ra các sản pham phụ mang tính acid làm pH của canh trƣờng hạ xuống. Môi trƣờng từ màu đỏ cam chuyển sang màu vàng.
Tiến hành:
Công thức môi trƣờng:
Bảng 2.6: Công thức môi trƣờng phân giải Manitol
Hóa chất Khối lƣợng Đƣờng Manitol 10 g Pepton 10 g NaCl 5 g Phenol Red 0,025 g Nƣớc 1 lít
- Đem môi trƣờng tiến hành chuan độ pH = 6,8 – 7,5.
- Sau khi pha xong môi trƣờng đem chia môi trƣờng vào các lọ thủy tinh chịu
nhiệt nhỏ, rồi đi hấp khử trùng cùng với đầu côn.
- Sau khi hấp xong để nguội môi trƣờng tiến hành nuôi lỏng. Lắc đều dịch nuôi lỏng chứa lƣợng sinh khối lớn trong môi trƣờng LB lỏng. Hút 100𝜇𝜇 dịch nuôi lỏng bơm vào mỗi lọ môi trƣờng đã hấp. Sau đó nuôi lắc ở 37 trong 24 giờ và quan sát.
2.6.3.4. Phân giải Saccharose
Môi trƣờng để thử hoạt tính phân giải saccharose tƣơng tự môi trƣờng KIA nhƣng thay đƣờng lactose bằng saccharose và vẫn chứa đƣờng glucose.
Về nguồn carbon, môi trƣờng KIA chứa hai loại đƣờng là 1% Saccarose và 0,1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trƣờng này có ba trƣờng hợp xảy ra đối với sự tăng trƣởng của VSV:
- Thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH của môi trƣờng, chỉ thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng và thạch nuôi cấy cũng chuyển từ đỏ sang vàng.
- Thứ hai: Sử dụng lactose và biến dƣỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trƣờng tăng chỉ thị Phenol Red chuyển từ vàng sang đỏ. Môi trƣờng chia 2 phần đỏ/ vàng sau 18 – 24 giờ nuôi cấy.
- Thứ ba: Không sử dụng cả hai đƣờng này. Acid amin là nguồn dinh dƣỡng duy
nhất, tạo NH3, giữ nguyên pH môi trƣờng, chỉ thị phenol red không đổi màu, thạch vẫn giữ nguyên màu đỏ trong suốtquá trình nuôi cấy.
- Nếu vi sinh vật có khả năng khử lƣu huỳnh thành H2S thì sẽ tạo kết tủa đen. Các vi sinh vật này thƣờng thuộc nhóm lên men glucose, không lên men lactose (đỏ/vàng).
- Salmonella chỉ lên men đƣợc đƣờng glucose nên phần nghiêng của môi trƣờng
có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.
Về sinh hơi: Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trƣờng này. Ngoài ra có thể thấy rõ hiện tƣợng sinh hơi qua hiện tƣợng làm vỡ thạch hoặc môi trƣờng bị đay lên trên tạo một khoảng trống bên dƣới đáy ống nghiệm.
2.6.3.5. Khả năng đề kháng kháng sinh
Một vi khuan đƣợc gọi là đề kháng khi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuan đó cao hơn nồng độ ức chế đa số các chủng vi khuan khác của cùng loài đó. Các mức độ của MIC xác định cho tính nhạy cảm, tính trung gian và tính đề kháng đối với mỗi loài vi khuan. Một số chủng đƣợc gọi là đề kháng
khi nồng độ KS mà vi khuan có thể chịu đựng đƣợc tăng cao hơn tăng cao hơn nồng độ kháng sinh đạt đƣợc trong cơ thể sau khi dùng thuốc.
Đối với thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của Salmonella S1. Đƣợc tiến
hành trên môi trƣờng LB đặc, trải dịch VSV đều lên bề mặt của thạch sau đó dùng phƣơng pháp đục lỗ thạch. Sau đó nhỏ lƣợng kháng sinh vừa đủ kín lỗ thạch. Kháng sinh đƣợc dùng trong thí nghiệm này là kháng sinh Gentamicin sulfate. Nồng độ 40mg/ml. Có hai trƣờng hợp xảy ra:
- Thứ nhất: VSV nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin sulfate nên không thể phát
triển phát triển đƣợc xung quanh lỗ thạch có kháng sinh.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN