2.6.1. Phƣơng pháp hoạt hóa và nhân giống chủng vi khuẩn Salmonella S1
Chủng Salmonella S1 đƣợc cung cấp bởi bộ môn Vi Sinh – Hóa Sinh viện
Công Nghệ Sinh học Lâm nghiệp. Phƣơng pháp:
- Chuan bị môi trƣờng LB (Lysogeny Broth) gồm có:
+ Pepton: 10g/lít
+ Cao nấm men: 5g/lít
+ NaCl: 5g/lít
+ Agar: 18 – 20g/lít
Sau khi chuan bị xong môi trƣờng LB môi trƣờng nuôi cấy vi khuan thông thƣờng, đầu côn đã hấp khử trùng. Tiến hành trải dịch VK lên môi trƣờng LB:
+ Từ ống đông khô hút 100 dịch VK Salmonella S1 trải lên môi trƣờng LB đặc.
+ Trải: Dùng que trải đều trên đĩa môi trƣờng đến khi khô lại đậy nắp, bọc màng bọc thực pham và nuôi trong 18 - 24 giờ ở 37 .
- Sau khi VK đã phát triển trên đĩa thạch 24 giờ tiến hành cấy ria để tạo khuan lạc riêng rẽ:
+ Tiến hành cấy ria để tinh sạch chủng vi khuan Salmonella. Các kỹ thuật cấy ria nhƣ: kiểu chữ chi; chữ T; ria 3 góc;…vết cấy cạn dần cho đến khi xuất hiện các khuan lạc riêng rẽ, thuần khiết.
2.6.2. Phƣơng pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một phƣơng pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuan thành 2 nhóm (Gram dƣơng và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuan Gram dƣơng sẽ giữ đƣợc phức hợp tím gentians-iod không bị tay màu bởi alcohol, trong khi vi khuan Gram âm không giữ đƣợc phức hợp này.
Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuan Gram dƣơng vẫn giữ đƣợc màu tím của gentians, còn vi khuan Gram âm bắt màu hồng của fucshin.
Tiến hành:
- Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm: Nhỏ một giọt nƣớc cất lên tấm lam kính sạch, sau
đó lấy 1/3 khuan lạc dàn đều tan hoàn toàn trong giọt nƣớc.
- Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn: Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách
hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuan sẽ biến dạng.
- Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuộm mẫu trong 1 phút.
- Rửa nƣớc tối đa 5 giây.
- Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút. - Rửa bằng rƣợu trong 10 giây.
- Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần
cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút).
- Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất. - Rửa qua nƣớc, để khô.
- Soi dƣới kính hiển vi vật kính 100x có giọt dầu.
2.6.3. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính của chủng Salmonella S1
2.6.3.1. Phân giải đường glucose, lactose và sinh H2S
Thử nghiệm sinh H2S trên môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar): Môi trƣờng KIA
đƣợc sử dụng thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau nhƣ glucose, lactose và khả năng sinh H2S. Dựa vào lên men glucose, lactose, sinh hơi và khử lƣu huỳnh để phân biệt các thành viên lên men và không lên men trong họ Enterobacteriaceae. Nhóm không lên men lactose thƣờng có khuynh hƣớng gây bệnh đƣờng ruột.
Về nguồn carbon, môi trƣờng KIA chứa hai loại đƣờng là 1% Lactose và 0,1%
glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trƣờng này có ba trƣờng hợp xảy ra đối với sự tăng trƣởng của VSV:
- Thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH của môi trƣờng, chỉ thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng và thạch nuôi cấy cũng chuyển từ đỏ sang vàng.
- Thứ hai: Sử dụng lactose và biến dƣỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trƣờng tăng chỉ thị Phenol Red chuyển từ vàng sang đỏ. Môi trƣờng chia 2 phần đỏ/ vàng sau 18 – 24 giờ nuôi cấy.
- Thứ ba: Không sử dụng cả hai đƣờng này. Acid amin là nguồn dinh dƣỡng duy
nhất, tạo NH3, giữ nguyên pH môi trƣờng, chỉ thị phenol red không đổi màu, thạch vẫn giữ nguyên màu đỏ trong suốtquá trình nuôi cấy.
- Nếu vi sinh vật có khả năng khử lƣu huỳnh thành H2S thì sẽ tạo kết tủa đen. Các vi sinh vật này thƣờng thuộc nhóm lên men glucose, không lên men lactose (đỏ/vàng).
- Salmonella chỉ lên men đƣợc đƣờng glucose nên phần nghiêng của môi trƣờng
có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.
Về sinh hơi: Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất
hiện các vệt màu đen trong môi trƣờng này. Ngoài ra có thể thấy rõ hiện tƣợng sinh hơi qua hiện tƣợng làm vỡ thạch hoặc môi trƣờng bị đay lên trên tạo một khoảng trống bên dƣới đáy ống nghiệm.
Tiến hành:
Chuan bị môi trƣờng KIA có pH = 6,8 0,2
Sau khi pha xong môi trƣờng đem chuan độ pH từ 6,8 ± 0,2
Bảng 2.4: Công thức môi trƣờng KIA
Hóa chất Khối lƣợng
Pepton 20 g
Lactose 20 g
Glucose 1 g
NaCl 5 g
Feric ammonium citrate(FeSO4) 0,5 g
Sodium thiosulfate 0,5 g
Agar 15 g
Phenol Red 0,0,25 g
Sau khi pha và chuan độ xong pH đem hấp khử trùng ở 121
- Sau khi hấp khử trùng xong đổ môi trƣờng vào các ống nghiệm mỗi ống
ngiệm 3ml để nghiêng và chờ cho các ống nguội.
- Khi môi trƣờng đã nguội dùng que cấy nhúng cồn hơ nóng đỏ để nguội
: Lấy một lƣợng sinh khối lớn khuan lạc đƣợc chọn cấy thấu xuống đáy của nghiệm và ria trên bề mặt nghiêng.
- Sau khi cấy VSV xong nuôi ở 37 ủ từ 18 – 24 giờ có thể ủ đến 48 giờ để theo dõi kết quả.
2.6.3.2. Thử nghiệm khả năng phân giải Urea
Thử nghiệm khả năng phân giải urea: Đƣợc thực hiện trên môi trƣờng urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Borth), chứa chỉ thị phenol red, chuyển từ màu vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu là pH 6.8 – 8,4).
Nguyên tắc: Sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt Urea thành ammonia hóa
do hoạt tính của urea từ vi sinh vật và kết quả là môi trƣờng bị kiềm hóa pH tăng lên do NH3 đƣợc tạo ra.
Tiến hành:
Chuan bị môi trƣờng RSU(Rustigian – Stuart – Urea Borth) Có pH = 6,8 ± 0,2
Bảng 2.5: Công thức môi trƣờng RSU
Hóa chất Khối lƣợng Uera 20 g Cao nấm men 0,1 g K2HPO4 9,5 g KH2PO4 9,1 g Phenol Red 0,01 g Nƣớc cất 1 lít
-Hấp khử trùng môi trƣờng và đầu côn 20 - 100𝜇 𝜇 ở 121 trong 20 phút, sau đó lấy ra để nguội
-Tiến hành hút 100𝜇𝜇 dịch Salmonella nuôi lỏng lắc đều cho vào 30ml môi trƣờng RSU đã nguội lắc đều và nuôi ở 37 trong 48 giờ.
- Môi trƣờng có màu hồng nhạt
2.6.3.3. Thử nghiệm phân giải đường Manitol
Thử nghiệm lên men đƣờng đƣợc thực hiện trên môi trƣờng lỏng chứa đƣờng
Manitol và chỉ thị Phenol Red.
Nguyên tắc: Môi trƣờng có chứa chỉ thị Phenol Red dùng để nhận biết sự phân
giải đƣờng Manitol. Nếu VSV lên men phân giải đƣờng thì sẽ tạo ra các sản pham phụ mang tính acid làm pH của canh trƣờng hạ xuống. Môi trƣờng từ màu đỏ cam chuyển sang màu vàng.
Tiến hành:
Công thức môi trƣờng:
Bảng 2.6: Công thức môi trƣờng phân giải Manitol
Hóa chất Khối lƣợng Đƣờng Manitol 10 g Pepton 10 g NaCl 5 g Phenol Red 0,025 g Nƣớc 1 lít
- Đem môi trƣờng tiến hành chuan độ pH = 6,8 – 7,5.
- Sau khi pha xong môi trƣờng đem chia môi trƣờng vào các lọ thủy tinh chịu
nhiệt nhỏ, rồi đi hấp khử trùng cùng với đầu côn.
- Sau khi hấp xong để nguội môi trƣờng tiến hành nuôi lỏng. Lắc đều dịch nuôi lỏng chứa lƣợng sinh khối lớn trong môi trƣờng LB lỏng. Hút 100𝜇𝜇 dịch nuôi lỏng bơm vào mỗi lọ môi trƣờng đã hấp. Sau đó nuôi lắc ở 37 trong 24 giờ và quan sát.
2.6.3.4. Phân giải Saccharose
Môi trƣờng để thử hoạt tính phân giải saccharose tƣơng tự môi trƣờng KIA nhƣng thay đƣờng lactose bằng saccharose và vẫn chứa đƣờng glucose.
Về nguồn carbon, môi trƣờng KIA chứa hai loại đƣờng là 1% Saccarose và 0,1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trƣờng này có ba trƣờng hợp xảy ra đối với sự tăng trƣởng của VSV:
- Thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH của môi trƣờng, chỉ thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng và thạch nuôi cấy cũng chuyển từ đỏ sang vàng.
- Thứ hai: Sử dụng lactose và biến dƣỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trƣờng tăng chỉ thị Phenol Red chuyển từ vàng sang đỏ. Môi trƣờng chia 2 phần đỏ/ vàng sau 18 – 24 giờ nuôi cấy.
- Thứ ba: Không sử dụng cả hai đƣờng này. Acid amin là nguồn dinh dƣỡng duy
nhất, tạo NH3, giữ nguyên pH môi trƣờng, chỉ thị phenol red không đổi màu, thạch vẫn giữ nguyên màu đỏ trong suốtquá trình nuôi cấy.
- Nếu vi sinh vật có khả năng khử lƣu huỳnh thành H2S thì sẽ tạo kết tủa đen. Các vi sinh vật này thƣờng thuộc nhóm lên men glucose, không lên men lactose (đỏ/vàng).
- Salmonella chỉ lên men đƣợc đƣờng glucose nên phần nghiêng của môi trƣờng
có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.
Về sinh hơi: Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trƣờng này. Ngoài ra có thể thấy rõ hiện tƣợng sinh hơi qua hiện tƣợng làm vỡ thạch hoặc môi trƣờng bị đay lên trên tạo một khoảng trống bên dƣới đáy ống nghiệm.
2.6.3.5. Khả năng đề kháng kháng sinh
Một vi khuan đƣợc gọi là đề kháng khi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuan đó cao hơn nồng độ ức chế đa số các chủng vi khuan khác của cùng loài đó. Các mức độ của MIC xác định cho tính nhạy cảm, tính trung gian và tính đề kháng đối với mỗi loài vi khuan. Một số chủng đƣợc gọi là đề kháng
khi nồng độ KS mà vi khuan có thể chịu đựng đƣợc tăng cao hơn tăng cao hơn nồng độ kháng sinh đạt đƣợc trong cơ thể sau khi dùng thuốc.
Đối với thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của Salmonella S1. Đƣợc tiến
hành trên môi trƣờng LB đặc, trải dịch VSV đều lên bề mặt của thạch sau đó dùng phƣơng pháp đục lỗ thạch. Sau đó nhỏ lƣợng kháng sinh vừa đủ kín lỗ thạch. Kháng sinh đƣợc dùng trong thí nghiệm này là kháng sinh Gentamicin sulfate. Nồng độ 40mg/ml. Có hai trƣờng hợp xảy ra:
- Thứ nhất: VSV nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin sulfate nên không thể phát
triển phát triển đƣợc xung quanh lỗ thạch có kháng sinh.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định một số đặc điểm sinh học của chủng Salmonella S1
3.1.1. Hình thái khuẩn lạc
Salmonella S1 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB đặc. Sau 48 giờ ta có kết quả
nhƣ hình 3.1
Hình 3.1: Khuẩn lạc của Salmonella S1 sau 2 ngày nuôi cấy
Hình thái: Khuan lạc riêng rẽ màu trắng đục, hình tròn lồi, bờ đều, trơn láng. Kích thƣớc 2 – 5 mm.
3.1.2. Hình dạng tế bào
Hình ảnh Salmonella S1 qua phƣơng pháp nhuộm Gram:
- Salmonella S1 là vi khuan Gram (-) nên bắt màu tím hồng của fucshin.
Vì lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuan Gram âm thì mỏng hơn của Gram dƣơng và thƣờng có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài. Sau khi nhuộm với phức hợp tím kết tinh - lugol, mẫu đƣợc xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nƣớc của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dƣơng, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím kết tinh – lugol bên trong tế bào.
Đối với vi khuan Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp tím kết tinh – lugol và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm fucshin.
Kết quả thu đƣợc nhƣ trên hình 3.1. Nhƣ vậy, chủng Salmonella S1 có
dạng hình que, là vi khuan Gram (-)
3.2. Kết quả xác định một số đặc điểm sinh hóa của chủng Salmonella S1
3.2.1. Lên men đƣờng glucose, lactose
Thử nghiệm lên men glucose, latose và sinh H2S trên môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar) chứa chỉ thị phenol red có pH = 6,8 ± 0,2. Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy ta đƣợc kết quả nhƣ hình 3.3
Nhận xét:
- Ong nghiệm thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH của môi trƣờng, chỉ
thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng và thạch nuôi cấy cũng chuyển từ đỏ sang vàng.
- Ở ống nghiệm thứ nhất thấy phần thạch bị đay hẳn lên khỏi đáy ống chứng tỏ có sinh hơi.
- Ở ống nghiệm thứ hai: vi sinh vật có khả năng khử lƣu huỳnh thành H2S tạo kết tủa đen. Và thấy ống nghiệm chia làm 2 màu đỏ trên phần thạch ghiêng và màu
vàng ở phần đáy ống chứng tỏ Salmonella S1 thuộc nhóm lên men glucose,
không lên men lactose (đỏ/vàng).
- Vì phần nghiêng của môi trƣờng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Nên
Salmonella S1 lên men kỵ khí – đáy và tạo ra các sản pham: Các acid hữu cơ, các
loại aldehyte, các loại rƣợu, khí CO2 , H2, H2S và năng lƣợng
3.2.2. Khả năng ản sinh H2S
Thử nghiệm lên men glucose, latose và sinh H2S trên môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar) chứa chỉ thị phenol red có pH = 6,8 ± 0,2. Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy ta đƣợc kết quả nhƣ hình 3.4
Salmonella S1 chỉ lên men glucose nên môi trƣờng có màu vàng và sinh
khí H2S gây ra hiện tƣợng vỡ thạch và đay thạch lên.
Không chỉ riêng có H2S đƣợc sinh ra mà là hỗn hợp khí gồm CO2 , H2, H2S do lên men glucose kỵ khí – đáy.
3.2.3. Khả năng phân giải Urea
Thử nghiệm khả năng phân giải urea: Đƣợc thực hiện trên môi trƣờng urea lỏng
RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Borth), chứa chỉ thị phenol red, chuyển từ màu vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu là pH 6.8 – 8,4). Sau khi nuôi lắc ở 37 trong 48 giờ lấy bình môi trƣờng ra và quan sát ta có kết quả sau:
Hình 3.5: Môi trường RSU trước và sau khi nuôi cấy
-Màu sắc của môi trƣờng RSU trƣớc và sau khi nuôi cấy không thay đổi vẫn là
màu hồng nhạt. Chỉ có canh trƣờng đục hơn vì sinh khối VSV phát triển (nhƣ hình 3.5)
-Chứng tỏ Salmonella S1 không phân giải urea nên môi trƣờng không bị kiềm hóa và không làm thay đổi màu sắc của môi trƣờng.
3.2.4. Khả năng phân giải đƣờng Manitol
Thử nghiệm lên men đƣờng đƣợc thực hiện trên môi trƣờng lỏng chứa đƣờng
Manitol và chỉ thị Phenol Red. Sau khi nuôi lắc ở 37 trong 24 giờ ta có kết quả : -Môi trƣờng ban đầu màu đỏ cam sau 18 - 24 giờ nuôi lắc đã đổi màu vàng tƣơi.
Hình 3.6: Môi trường Manitol trước khi nuôi cấy
Hình 3.7: Môi trường Manitol sau khi nuôi
Sau khi nuôi lắc 24 giờ nuôi lắc chủng Salmonella S1 đã phân giải đƣờng
manitol tạo ra các sản pham phụ mang tính acid làm hạ pH của môi trƣờng pH < 6,8 khiến môi trƣờng chuyển từ màu đỏ cam sang vàng. pH ban đầu của môi trƣờng là từ 6,8 – 7,5 .
Kết quả của thí nghiệm là sinh acid (+) môi trƣờng màu đỏ cam -> vàng , sinh hơi (-) xuất hiện bọt khí.
3.2.5. Khả năng lên men đƣờng Saccharose
Sau khi nuôi ở 37 trong 48 giờ ta có kết quả sau:
Hình 3.8: Kết quả lên men đường saccharose
- Môi trƣờng bị phân ra 2 màu rõ rệt nhất là ống 1, ống 3, ống 4. Chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose mà không lên men saccarose.
- Ong 1, 3, 5 có xuất hiện khoảng trống dƣới đáy ống nghiệm chứng tỏ có hiện