- Nước ta có một trong những thực vật phong phú nhất thế giới với khoảng 12.000 loài, chưa kể tới các Rong, Rêu, Nấm. Bên cạnh đó, YHCT Việt Nam cũng đang phát triển với bề dày kinh nghiệm được lưu truyền qua các thế hệ. Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong gian gian để điều trị nhiều bệnh lý trong đó phải kể tới các bệnh liên quan tới gốc tự do như ưng thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường. Tuy nhiên, những bằng chứng khoa học về những cây này chưa có hoặc còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa.
Vùng bảy Núi thuộc huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang là một đại danh gắn liền với nền thực vật phong phú với các quần thể rừng của Bảy Núi trong kiểu rừng kín nửa rụng lá, ẩm nhiệt đới với cấu trúc 3 tầng rõ rệt: tầng cây gỗ như dầu, căm xe, lăng ổi, bời lời, quế, gõ mật, nính..., tầng cây bụi như sâm ngọt, sâm núi, mua lông, bưởi, chanh…, tầng thân thảo và quyết thực vật như sa nhân, gừng dại, giềng rừng. Đi cùng với sự đa dạng của nền thực vật nơi đây, nền YHCT tại vùng này cũng phát triển với nhiều loài cây thuốc quí.
Nghĩa Đàn là huyện trung du miền núi nằm về phía Bắc - Tây Bắc của tỉnh Nghệ An, được thiên nhiên ban tặng cho tài nguyên đất đỏ bazan, nên thực vật cũng tương đối đa dạng và có những cây thuốc quí được sử dụng trong YHCT.
- Họ Cà phê (Rubiaceae) cũng là một họ lớn, phong phú về dạng cây. Nhiều loài cây thuộc chi Nauclea (Gáo) nói chung và cây N. orientalis cũng đã được nghiên cứu về thành phần hóa học. Các nghiên cứu theo định hướng phân lập alkaloid từ cao ammoniac và cao chloroform. Do vậy, các hợp chất đã phát hiện được chủ yếu thuộc họ alkaloid, ngoài ra còn có một số hợp chất terpenoid và polyphenol. Những hợp chất này có những hoạt tính sinh học qui báu nhưng chưa phải là những chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh.
- Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa thì có nhiều và tuân thủ theo nhiều cơ chế khác nhau. Do đó, để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu thử cần phải tiến hành trên ít nhất hai phương pháp.
22 1.3.2. Định hƣớng nghiên cứu
Từ những nhận định trên, chúng tôi đưa ra những định hướng cho nghiên cứu của mình như sau:
- Tiến hành sàng lọc các cây thuốc theo vùng Bảy Núi (An Giang) và Nghĩa Đàn (Nghệ An) nhằm lựa chọn ra một cây thuốc có hoạt tính mạnh, phục vụ cho nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của chúng.
- Hai phương pháp được lựa chọn nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa in vitro là phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, ức chế quá trình peroxide hóa lipid (MDA test). Đây là hai phương pháp tuân theo một cơ chế cho proton (HAT)- cơ chế phổ biến của các chất kháng oxy hóa.
- Cây N. Orientalis đã được nghiên cứu về thành phần hóa học. Song, những hoạt chất kháng oxy hóa thì chưa tìm thấy được ở cây này. Chúng tôi tập trung theo hướng phân lập các hoạt chất kháng oxy hóa, không tập trung nghiên cứu trên các cao có chứa nhiều alkaloid.
23 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT 2.1.1. Hóa chất và thiết bị 2.1.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1.1. Hóa chất
- Dung môi: n-he xane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 90o (Chemsol, Việt Nam)
- Thuốc thử hiện hình vết trên sắc ký lớp mỏng: H2SO4 30%, nung nóng - Sắc ký lớp mỏng pha thường: TLC silica-gel 60 F254 (250 µm, Merck) - Sắc ký cột pha thường: silica-gel 60 (0,0400,063 mm, Himedia)
2.1.1.2. Thiết bị
- Cột sắc ký
- Bình triển khai sắc ký lớp mỏng
- Đèn U V (Spectroline model ENF-240C/FE, USA) - Cân phân tích (Sartorious BL 210S)
- Tủ sấy (Memmert) - Máy chiết Soxhlet
- Hệ thống cô quay chân không (Buchi) - Bếp cách thủy (Memmert)
- Máy cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Avance) với tần số 500 MHz cho phổ 1
HNMR và 125 MHz cho phổ 13
CNMR(a)
- Máy đo khối phổ HRESIMS (microOTOF–Q 10187) (a)
(a) Thực hiện tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.2. Nguyên liệu
Thu thập và định danh mẫu
36 mẫu cây được thu hái tại vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (9/2008) tại vùng Phủ Qùy, huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An (3/2010) theo ba tiêu chí lựa chọn bao gồm: kinh nghiệm dân gian và tham khảo tài liệu và ngẫu nhiên (bảng 2.1).
24
Trích lại 2 lần
Các mẫu cây được định danh bởi Ths Hoàng Việt và Ths. Nguyễn Trần Quốc Trung, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu khô của 36 cây hiện được lưu giữ trong quyển lưu tiêu bản thực vật, đặt tại Bộ môn Hóa Phân Tích, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.3. Điều chế các loại cao
2.1.3.1. Điều chế cao MeOH từ 36 mẫu cây
Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích
2.1.3.2. Điều chế các loại cao từ thân cây N. orientalis
Bột khô thân cây N. orientalis (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp chiết Soxhlet với methanol. Dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích thô methanol (1 kg). Phần cao thô methanol được phân tán vào một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt rồi tiến hành trích trích lỏng –lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, chloroform và ethyl acetate. Các phần dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng là cao n-hexane (6g), cao chloroform (3.9 g), cao ethyl acetate (50 g) và cao nước (900 g). Khối lượng và thu suất các loại cao tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu được trình bày trong bảng 2.3.
Cô quay Cao MeOH Mẫu cây Dịch trích Trích nóng với M eOH, 600 C Bã
25
Bảng 2.1. Danh mục 36 cây thuốc của An Giang và Nghệ An [1-2]
Tên khoa học Họ Bộ phận
dùng
Tên thƣờng gọi
Công dụng Cây thuốc An Giang
Ageratum conyzoides L. Cúc
Asteraceae
Phần trên không
Cây cứt lợn Kháng viêm, mụn nhọt, viêm xoang
Albizia myriophylla Benth. Đậu
Fabaceae
Vỏ Cam thảo cây Giả độc, mụn nhọt, ho
Antidesma ghaesembilla Gaertn. Thầu dầu
Eup horbiaceae
Thân Chồi môi Ho, rối loạn tiêu hóa, giả độc
Artemisia vulgaris L. Cúc
Asteraceae
Lá Ngãi cứu Đau đầu, rối loạn kinh nguyệt, đau lưng,
viêm khớp
Artocarpus altilis (Park.) Fosb. Dâu tằm
Moraceae
Vỏ Xa kê Lợi tiểu
Boehmeria nivea (L) Gaud. Gai
Urticaceae
Lá Gai Lợi tiểu, cám cúm, sốt rét, viêm thận
Borassus flabellifer L. Cúc
Arecaceae
Hoa Thốt nót (đực) Lợi tiểu, kháng viêm
Cassia alata L. Đậu
Fabaceae
Thân Muồng trâu Bệnh ngoài da
Christia vespertilionis (L.f) Bakh.f. Đậu
Fabaceae
Toàn thân Ngãi bướm Lợi tiểu, tim mạch
Chrysopogon aciculatus (Retz.) Trin. Cỏ
Poaceae
Toàn thân Cỏ may Lợi tiểu, viêm gan, giải độc
Circus japonicus. (DC.) Maxim Cúc
Asteraceae
Toàn thân Ô rô Viêm thận, chảy máu tử cung
26
Cucurbitaceae
Coix lachryma- jobi L. Lúa
Poaceae
Hạt Cườm gạo Kháng khuẩn, viêm đường tiết niệu, kháng
viêm
Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. Đậu
Fabaceae
Toàn thân Kim tiền thảo Sỏi thận, viêm gan, viêm đường tiết niệu
Fibraurea tinctoria Lour. Tiết dê
M enisp ermaceae
Thân Hoàng đằng Kháng viêm, viêm gan, sốt rét, thuốc bổ
Nauclea orientalis L. Cà p hê
Rubiaceae
Thân Gáo vàng Xơ gan cổ trướng, viêm gan
Plantago asiatica L. M ã đề
Plantaginaceae
Phần trên không
M ã đề Kháng viêm, viêm gan, ho, lợi tiểu
Uvaria micrantha (A.DC.) Hook. F. et
Thoms.
Na Annonaceae
Thân Kỳ hương Lợi tiểu, rối loạn tiêu hóa, đau lưng
Vitex negundo L. Cỏ roi ngựa
Verbenaceae
Toàn thân Ngũ trảo Viêm khớp, cảm cúm, cảm lạnh, nhức mỏi,
bán than bất toại
Xanthium strumarium L. Cúc
Comp ositae
Hạt Ké đầu ngựa Ung thư, mụn nhọt
Cây thuốc Nghệ An
Bougainvillea spectabilis Willd. Hoa giấy
Ny ctaginaceae
Lá Hoa giấy Lợi tiểu
Carica papaya L. Đu đủ
Caricaceae
Lá Đu đủ (đực) Ung thư, kháng kháng viêm
Catharanthus roseus (L.) G. Don Trúc đào
Ap ocy naceae
Toàn thân Dừa cạn Ung thư, tiểu đường, huyết áp cao
Ceiba pentandra (L.) Gaerth. Var. indica
(DC.) Bakh
Gạo Bombacaceae
Vỏ Gòn Viêm thận, viêm khớp, ho
Eleutherine subaphylla Gagnep . Lá đơn
Iridaceae
27
Gossampinus Gạo
Bombacaceae
Hạt Lúa Nguồn dinh dưỡng, huyết áp cao
Herba Siegesbeckiae Cúc
Asteraceae
Toàn thân Hy thiêm thảo Viêm khớp, đau lưng
Lactuca indica L. Cúc
Asteraceae
Toàn thân Bồ công anh Kháng viêm, lợi tiểu, tắc tuy ến sữa
Lonicera japonica Thunb. Kim ngân
Cap rifoliaceae
Hoa, lá Kim ngân Lợi tiểu, mụn nhọt
Morinda itrifolia L. Cà p hê
Rubiaceae
Quả Nhàu Tiểu đường, huyết áp cao, ung thư
Pluchea indica (L.) Less. Cúc
Asteraceae
Toàn thân Cúc tần Lợi tiểu, kháng khuẩn
Punica granatum L. Lựu
Punicaceae
Lá Lựu Tim mạch, đau răng, sốt rét
Raphidophora aurea (Lindl. Et Andre)
Bidsey
Ráy Araceae
Lá Trầu không Kháng viêm, giả độc, sát trùng, đau mắt
Schefflera octophylla (Lour.) Harms Nhân sâm
Araliaceae
Thân, lá Ngũ gia bì Lợi tiểu, kháng viêm
Solanum melongena L. Cà
Solanaceae
M ào cà Cà p háo Ung thư, kháng viêm
Stevia rebaudiana (Bert) Hemsl. Cúc
Asteraceae
28
2.1.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ từ thân cây N.orientalis
Tiến hành thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên tất cả các loại cao methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate và cao nước nhằm lựa chọn cao có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, làm cơ sở cho cô lập các hoạt chất. Áp dụng phương pháp sắc ký cột pha thường trên các cao được lựa chọn để tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau. Tiếp tục sử dụng các phương pháp sắc ký trên các phân đoạn thu được, như sắc ký cột silica gel pha thường hoặc pha đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, kết hợp soi đèn UV, hiện vết bằng dung dịch H2SO4 30% và sấy nóng.
Từ cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis đã cô lập được 06 hợp chất được đánh số từ GV-1 cho đến GV-6. Các kết quả được trình bày trong bảng 2.5.
Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis
Phân đoạn Dung môi giải ly SKC
Khối lƣợng Kết quả
SKBM
Ghi chú
GV-A n-H:A 0.92 g Nhiều vết Không khảo sát
GV-B n-H:A 17.8 g Vết rõ Khảo sát, thu được 01 hợp chất
GV-4 (12g)
GV-C C:M 5.0 g Vết rõ Khảo sát, thu được 04 hợp chất
GV-1 (30.3 mg) GV-2 (50.7 mg
GV-5 (5.3 mg) GV-6 (10.7 mg)
GV-D C:M 8.0 Vết rõ Khảo sát, thu được 01 hợp chất
GV-4 (20.8 mg)
GV-E E:M :H 11.2 g Vết rõ Khảo sát, thu được 01 hợp chất
(16:1:1) GV-3 (8 g)
GV-F E:M :H
(16:1:1)
29
2.3. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA
2.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng thử nghiệm ức chế gốc tự do DPPH
2.3.1.1. Hóa chất và thiết bị
- DPPH (Sigma)
- Ethanol (Chemsol, Việt Nam) - Trolox (Sigma)
- Nước cất
- Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis (Shimadzu U V-1800)
- Các dụng cụ thông thường khác như: erlen, becher, pippetman, ependorf, đầu tip, falcol, micropipette.
2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch DPPH 100 µM (hòa tan 3.94 mg DPPH vào 100 ml dung môi ethanol).
- Dung dịch làm việc ban đầu của mẫu thử của cao thô và cao phân đoạn có nồng độ 500 µg mL-1 (pha bằng dung môi ethanol).
- Các mẫu thử được tiến hành ở các nồng độ khảo sát là 100, 50, 25, 10 µg ml-1. Đối với những mẫu thử có hoạt tính mạnh, ức chế trên 50 tại nồng độ 10 µg ml-1, ta tiếp tục tiến hành thử ở các nồng độ thấp hơn: 10, 5, 2.5, 1 µg ml-1. Khi đó sử dụng mẫu làm việc có nồng độ 100 µg mL-1.
- Mẫu blank được chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng thay VD PPH bằng Vethanol. - Mẫu control là mẫu chỉ chứa dung dịch DPPH.
- Tại một nồng độ khảo sát đều thực hiện các phép thử trên mẫu blank, mẫu thử. - Trolox được sử dụng làm chất đối chứng dương.
Lưu ý: nếu mẫu thử là chất tinh khiết thì nồng độ mẫu pha theo nồng độ µmol ml-1.
2.3.1.3. Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH được trình bày trong sơ đồ 2.4:
SKC, E:M :H (16:1:1)
30 1500 L dung dịch mẫu Dung dịch sau ủ Đo quang ở 517 nm V1L mẫu V2L ethanol - Thêm 1500 L DPPH (100 M) Ủ trong bóng tối 30 phút
Sơ đồ 2.2. Qui trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
2.3.1.4. Xử lý kết quả
Khả năng kháng oxy hoá được tính dựa trên phần trăm ức chế (I ):
I () = Ac - As
Ac 100 Trong đó:
Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control). As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample).
Mỗi mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µgmL-1. Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần, thu được 3 giá trị phần trăm ức chế (I ). Lấy trung bình 3 giá trị đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát. Từ đó, xác định được giá trị IC50 (nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do).
2.3.1.5. Nơi thực nghiệm thử nghiệm
Phòng thí nghiệm Hóa Dược, Bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh.
31
2.3.2. Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid
2.3.2.1. Hóa chất và thiết bị
-Thiobarbituric acid, TBA (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) - Tricloacetic acid TCA (Sigma)
- Đệm Phosphat, PBS
- Trolox (Calbiochem Ltd. Co.) - Dimethylsulfoside, DMSO (Merck ) - Cân kĩ thuật Mettler Toledo AB204.
- Thiết bị nghiền đồng thể (KA Works, Asia Sdn. Bhđ, Malaysia) - Máy ổn nhiệt (Desconectar)
- Máy ly tâm lạnh Sartorius (Germany)
- Máy đo quang phổ UV-Vis (Unicam, HE λ 10 SY vision 32 Software, thermo Spectrorius)
2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu
a) Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực, Mus musculus var Albino, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2 g, được cung cấp bởi viện vắc xin và sinh phẩm y tế–TP. Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột được nuôi đầy đủ bằng thực phẩm viên, giá, rau xà lách và nước uống đầy đủ.
b) Chuẩn bị mẫu
- Pha dung dịchTBA 0,8 %; TCA 10%, đệm phosphate 5mM.
- Các mẫu thử được tiến hành ở các nồng độ khảo sát là 1000, 500, 250, 100, 50, 10 µg ml-1.
Trolox được sử dụng làm chất đối chứng dương.
Lưu ý: nếu mẫu thử là chất tinh khiết thì nồng độ mẫu pha theo nồng độ µmol ml-1.
2.3.2.3. Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid
Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình pero xide hóa lipid được trình bày trong sơ đồ 2.4:
2.3.2.4. Tính kết quả
32
HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100
ODC: Mật độ quang của chứng dung môi (DMSO); ODT: Mật độ quang của mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo khác nhau.
Sơ đô 2.3. Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid
Mỗi mẫu được thử ở 5 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ được tiến hành 2 lần, thu được 2 giá trị % hoạt tính kháng oxy hóa (HTCO%). Lấy trung bình 2 giá trị đó ta sẽ xác định được hoạt tính kháng oxi hóa ứng với từng nồng độ khảo sát. Từ đó, xác định được giá trị IC50 (nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do).
2.3.2.5. Nơi thực hiện thử nghiệm
Thử nghiệm được thực hiên tại trung tâm Sâm và Dược liệu, Thành phố Hồ Chí Minh. Tách não chuột Nghiền đồng thể trong đệm PBS 5mM (1:10), 0-50C Chuột nhắt 20 ± 2 g, 5-6 tuần tuổi Mẫu thử (0.1 ml) -Nghiền đồng thể Dịch đồng thể (0.5 ml) 1000C, 15 phút TCA 10% (1 ml) Ly tâm 104 vòng/phút Ủ tại 370 C, 15 phút Đệm PBS (1.4 ml) TBA 0.8% (1 ml) Hỗn hợp Hỗn hợp sau ủ Dịch trong suốt (2ml)
33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OX Y HÓA