2.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng thử nghiệm ức chế gốc tự do DPPH
2.3.1.1. Hóa chất và thiết bị
- DPPH (Sigma)
- Ethanol (Chemsol, Việt Nam) - Trolox (Sigma)
- Nước cất
- Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis (Shimadzu U V-1800)
- Các dụng cụ thông thường khác như: erlen, becher, pippetman, ependorf, đầu tip, falcol, micropipette.
2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch DPPH 100 µM (hòa tan 3.94 mg DPPH vào 100 ml dung môi ethanol).
- Dung dịch làm việc ban đầu của mẫu thử của cao thô và cao phân đoạn có nồng độ 500 µg mL-1 (pha bằng dung môi ethanol).
- Các mẫu thử được tiến hành ở các nồng độ khảo sát là 100, 50, 25, 10 µg ml-1. Đối với những mẫu thử có hoạt tính mạnh, ức chế trên 50 tại nồng độ 10 µg ml-1, ta tiếp tục tiến hành thử ở các nồng độ thấp hơn: 10, 5, 2.5, 1 µg ml-1. Khi đó sử dụng mẫu làm việc có nồng độ 100 µg mL-1.
- Mẫu blank được chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng thay VD PPH bằng Vethanol. - Mẫu control là mẫu chỉ chứa dung dịch DPPH.
- Tại một nồng độ khảo sát đều thực hiện các phép thử trên mẫu blank, mẫu thử. - Trolox được sử dụng làm chất đối chứng dương.
Lưu ý: nếu mẫu thử là chất tinh khiết thì nồng độ mẫu pha theo nồng độ µmol ml-1.
2.3.1.3. Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH được trình bày trong sơ đồ 2.4:
SKC, E:M :H (16:1:1)
30 1500 L dung dịch mẫu Dung dịch sau ủ Đo quang ở 517 nm V1L mẫu V2L ethanol - Thêm 1500 L DPPH (100 M) Ủ trong bóng tối 30 phút
Sơ đồ 2.2. Qui trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
2.3.1.4. Xử lý kết quả
Khả năng kháng oxy hoá được tính dựa trên phần trăm ức chế (I ):
I () = Ac - As
Ac 100 Trong đó:
Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control). As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample).
Mỗi mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µgmL-1. Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần, thu được 3 giá trị phần trăm ức chế (I ). Lấy trung bình 3 giá trị đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát. Từ đó, xác định được giá trị IC50 (nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do).
2.3.1.5. Nơi thực nghiệm thử nghiệm
Phòng thí nghiệm Hóa Dược, Bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh.
31