Từ kết quả thử nghiệm DPPH, 3 hợp chất tinh khiết được phân lập từ thân cây
N. orientalis được lựa chọn để tiếp tục thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp MDA (phụ lục 7). Đây là phương pháp xác định khả năng ức chế peroxide hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA ), là sản phẩm của quá trình peroxide hóa lipid màng tế bào. Phương pháp này cũng tuân theo cơ chế HAT giống như mô hình thử DPPH. Trolox được lựa chọn làm chất đối chứng dương.
45
Bảng 3.12. Hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid của 3 hợp chất đƣợc lựa chọn Hợp chất 2000 µM 1000 µM Phần trăm ức chê (%) 500 µM 250 µM 100 µM 50 µM ICµM 50 GV-2 51.5 ±1.9 1.8 ±1.4 988.1 GV-3 91.6 ±2.8 70.6±1.2 60.9±4.0 37.4±3.4 28.2±3.2 13.7±1.7 180. 9 GV-5 81.5 ±2.5 73.9 ±1.7 70.3±1.9 42.8 ±3.6 6.7 ±1.7 139.2 (): Không có hoạt tính Nhận xét
Kết quả thử nghiệm cho thấy (bảng 3.12), 3 hợp chất (chiếm 100 %) thể hiện hoạt tính tại nồng độ 2000 và 1000 µM, 2 hợp chất (chiếm 77,7 %) có hoạt tính tại nồng độ 500, 250 và 100 µM, 01 hợp (chiếm 33.3 %) có hoạt tính ức chế tại nồng độ 50 µM. Theo kết quả IC50 nhận thấy, có 3 (chiếm 100 %) hợp chất có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng dương Trolox (IC50, 2265.6 µM) . Nhìn chung, các hợp chất thử nghiệm đều có hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid rất mạnh và mạnh hơn cả chất đối chứng dương Trolo x.
Đánh giá
Nhìn chung các hợp chất có hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH thì đều có hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid và hết sức đặc biệt khi hoạt tính ức chế này mạnh hơn cả hoạt tính của chất đối chứng dương trolox. Mô hình thử MDA được thực hiện
in vitro nhằm nghiên cứu quá trình peroxide trên não chuột. Phương pháp thử này cũng tuân thủ theo cơ chế HAT giống như phương pháp DPPH. Điều này được xác nhận bằng thực tiễn thông qua các kết quả nhận được trên hai mô hình thử đều tương tự nhau. Qua đó, chúng tôi đưa ra một số nhận định sau:
- Cả hai phương pháp thử đều tuân theo cơ chế HAT, do đó chỉ những hợp chất có khả năng nhường proton của vòng benzene thì mới có hoạt tính này. Các polyphenol đơn giản có hoạt tính kháng oxy hóa rất mạnh với cấu trúc có cặp –OH ở vị trí orto. Số lượng cặp –OH ở vị trí orto sẽ làm gia tăng hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH lên rất nhiều (từ không có thành mạnh và rất mạnh).
46 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Đề tài thực hiện việc đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của 36 cây thuốc An Giang và Nghệ An bằng phương pháp thử nghiệm ức chế gốc tự do DPPH Từ kết quả sàng lọc, chúng tôi lựa chọn cây thuốc Nauclea orientalis L.có hoạt tính mạnh để nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa in vitro bằng hai phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxide hóa lipid.
Một số kết quả nhận được như sau:
KẾT Q UẢ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OX Y HÓA
36 mẫu cao MeOH trích ly từ 36 cây thuốc của vùng Bảy Núi (An Giang) và Phủ Quỳ (Nghệ An) đã được nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH.
Năm cây thuốc bao gồm R. aurea,P. granatum, B. flabellifer, Gossampinus và
N. orientalis thể hiện hoạt tính mạnh và sẽ là tiềm năng cho các nghiên cứu phân lập hoạt chất kháng oxy hóa về sau.
KẾT Q UẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Từ thân cây N. orientalis, sử dụng phương pháp trích cao methanol (chiết Soxhlet), cùng với các phương pháp s ắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế, 6 hợp chất đã được cô lập. Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại 1D và 2D–NMR, kết hợp với so sánh với các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã xác định được cấu trúc hóa học của 06 hợp chất này.
Sáu hợp chất bao gồm: 4-hydroxylbenzoic acid (GV-1), protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV-3), umbelliferone (GV-4), esculetin (GV-5), scopoletin (GV-6).
Đây là những hợp chất lần đầu tiên được cô lập từ thân cây N. orientalis và chi
Nauclea. Các nghiên cứu trước kia về loài N. orientalis nói riêng và chi
Nauclea do chỉ tập trung nghiên cứu phân lập alkaloid nên chưa tìm thấy sự đa dạng các nhóm hợp chất trong chi này và tìm ra được hợp chất đặc trưng khác của cây này.
47
06 hợp chất được phân lập từ hai cây nghiên cứu đều được thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. 03 chất (chiếm 50%) có hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh là 4- , protocatechuic acid ( GV-2), gallic acid (GV-3), esculetin (GV-5).
03 hoạt chất này được lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình ức chế quá trình peroxide hóa lipid. Theo kết quả IC50 nhận thấy, 03 hợp chất này đều có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng dương Trolox (IC50, 2265.6 µM). Hai hợp chất gallic acid (GV-3), esculetin (GV-5) có hoạt tính ức chế quá trình pero xide hóa lipid mạnh.
Đây là kết quả đầu tiên công bố hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid của hợp chất esculetin (GV-5).
KIẾN NGHỊ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
- Tiếp tục nghiên cứu cô lập các hợp chất trên các phân đoạn chưa được khảo sát của các cao trích trên thân cây N. orientalis.
- Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của một số chất có hoạt tính mạnh trên các mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo, nhằm tìm ra hợp chất tinh khiết có hoạt tính mạnh, có khả năng ứng dụng trên lâm sàng.
48 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Faheem I. P. (2005), Activity guided separation of phytoconstituents from Tephrosia procumbens Buch-Ham and evaluation for antioxydant property,
Master of pharmacy in pharmacognosy.
[2] Ranjith A. (2009), Phytochemical investigations on sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) Berries, Doctor of philosophy in chemistry.
[3] Leo M. A. H., Dekhuijzen P. N. D. (2000), Respiratory muscle function and free radicals from cell to COPD, Thorax, 55, 704-716.
[4] Eva S. (2000), Lipid peroxydation in vivo, Acta universitatis upsaliensis Uppsala. [5] Pramote M. (2003), Study on the antioxydant and free radical – scavenging
activities of a traditional Kampo medicine, Choto – san, and its related constituents,Doctor of philosophy.
[6] Ayse K., Beraat O., Samim S. (2009), Review of methods to determine
antioxydant capacities, Food Anal. Methods,2, 41–60.
[7] Molyneux P. (2004), The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) forestimating antioxydant activity, Songklanakarin Journal of Science and Technolog, 26, pp. 211-219.
[8] Phạm Hoàng Hổ (2006), Cây có vị thuốc ở Việt Nam, NXB Trẻ.
[9] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội.
[10] Zhen, D.H., Cui, Y.M., Hong, J.Z., Ghee, T.T, Pamela, T., Kongmany S., Bouamanivong, S., Bounhoong S., Djaja D. S. (2005), Antimalarial constituents from Nauclea orientalis (L.), Chem. Biodiversity, 2, 1378 - 1386.
[11] Eiichi, F., Tesuro, F., Toyoko, S. (1967), On the constituents of Nauclea orientalis L. I. noreugein and naucleoside, anew glycoside. (Terpenoids V), Chem. Pharm. Bull., 15(11), 1682-1686.
[12] Jirapast, S., Serm, S., Pongpun, S., Suttira, K., Jonkolnee, J., Santi, T., (2010), Two new cytotoxic isomeric indole alkaloids from the roots of Nauclea orientalis,
Fitoterapia, 81, 830 – 833.
[13] Jirapast, S., Wisuttaya, W., Santi, T. (2012), Chemical constituents from the roots of Nauclea orientalis, Chem. Nat. Compd., 48 (5), 827-830.
[14] J.Zhou et al. (2011), Encyclopedia of traditional Chinese medicines molecular structures, pharmacological activities, Natural Sourcesand Applications, 1 Isolated Compounds A-C.
49
[15] J. Zhou et al. (2011), Encyclopedia of Traditional Chinese Medicines Molecular Structures, Pharmacological Activities, Natural Sourcesand Applications, 2: Isolated Compounds D-G.
[16] J. Zhou et al. (2011), Encyclopedia of Traditional Chinese Medicines Molecular Structures, Pharmacological Activities, Natural Sourcesand Applications, 3: Isolated Compounds H-M.
[17] J. Zhou et al. (2011), Encyclopedia of Traditional Chinese Medicines Molecular Structures, Pharmacological Activities, Natural Sourcesand Applications, 4: Isolated Compounds H-M.
[18] Fan L., Fan C., Wang Y., Zhang X.,Zhang Q., Zhang J., Ye W. (2010), Alkaloids from the leaves of Nauclea officinalis, Acta Pharmaceutica Sinica, 45 (6), 747−751.
[19] Sook Y. L., Mat R. M., A. Hamid A. Hadi 1, Khalijah A. Mohd R.Mustafa, Kazumasa Z., Hiroshi M., Marc L. (2012), Naucline, a New Indole Alkaloid from the Bark of Nauclea officinalis , Molecules 17, 4028-4036.
[20] Kui S., Min G., Jing Z., Shiming D. (2009), Study on Chemical Composition of Nauclea Officinalis Leaves, International Journal of Chemistry, 1 (2), 77-81. [21]Wang M., Kikuzaki H., Zhu N., Sang S., Nakatani N., Ho C. (2000), Isolation and
Structural Elucidation of Two New Glucosides from Sega (Salvia officinalis L.),
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2, 235-238.
[22]Ramadan M. A., Ahmad A.S., Nafady A.M., Mansuor A.I. (2009), Chemical Composition the Stem Bank and Leaves of Ficus pandurata Hance, Natural Product Research, 13, 1218-1230.
[23] Chen Z., Lui Y., Yang S., Song B., Xu G., Bhadury P. S., Jin L., Hu D., Liu F., Xue W., Zhou X. (2008), Studies on the Chemical Constituents and Anticancer Activity of Saxifra stolonifera (L.) Meeb, Bioorganic and Medical Chemistry, 3, 1337-1344.
[24] Monika G. G., Tadeusz K. (2009), Flavonoids and Coumarins from Hieracium pilosella L. (Asteraceae), Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 78 (3), 189 - 195, 2009.
50
[25] Lu. X.L., Qiao. Y., Zhang. X.M., Ma. B.L., Qiu M.H. (2007), Chemical consituents from Ceratophyllum demersum (Ceratophyllaceae), Acta Botanica Yunnanica, 29(2), 263-264.
[26] Dong Qing F., Mohammad A., Jamal R., Kun G. (2009), Chemical constituents from the aerial parts of Sophora mollis”, Chemistry of natural compound, 45, 896-897.
51 PHỤ LỤC
HỢP CHẤT GV-1 (CD3OD)
Phụ lục 1a. Phổ 1H-NMR của chất GV-1
52
HỢP CHẤT GV-2 (ACETONE-D6)
Phụ lục 2a: Phổ 1
H-NMR của hợp chất GV-2
53
HỢP CHẤT GV-3 (CD3OD)
Phụ lục 3a: Phổ 1
H-NMR của hợp GV-3
54
HỢP CHẤT GV-4 (ACETONE-D6)
Phụ lục 4a: Phổ 1
H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-4
55
Phụ lục 4c: Phổ COS Y-NMR của hợp chất GV-4
56
Phụ lục 4e: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-4
HỢP CHẤT GV-5 (ACETONE-D6)
Phụ lục 5a: Phổ 1
57
Phụ lục 5b: Phổ 13C-NMR của hợp chất GV-5
58
Phụ lục 5d: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-5
HỢP CHẤT GV-6 (ACETONE-D6)
59 Phụ lục 6b: Phổ 13
C-NMR của hợp chất GV-6
60
61 Viện Dƣợc Liệu
Trung Tâm Sâm & Dƣợc Liệu-Tp. HCM
PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ
I. Mẫu nghiên cứu:
Mẫu thử ký hiệu: 03, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, R-2.
Người cung cấp mẫu: Phan Thị Anh Đào. Các mẫu được pha trong dung môi DMSO. Thử nghiệm yêu cầu: MDA não in vitro.
Các nồng độ thử nghiệm theo yêu cầu: 2000; 1000; 500; 250; 100; 50; 10 (μM).
II.Phƣơng pháp nghiên cứu:
1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào (thử nghiệm MDA) [1,2]:
Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở = 532 nm.
0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não và thêm đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ 100oC. Làm lạnh và tiến hành đo quang ở bước sóng = 532nm. Trolo x (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu.
2. Tính toán kết quả
Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):
HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100
ODC: Mật độ quang của chứng dung môi (DMSO). ODT: Mật độ quang của mẫu thử.
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo khác nhau.
62 III. Kết quả nghiên cứu:
1- Kết quả sàng lọc
Các mẫu có HTCO < 50% ở nồng độ 1000 μg/ml được khảo sát sàng lọc tiếp ở nồng độ 2000 μg/ml: Mẫu 12, 19, 21, 23.
Các mẫu có HTCO < 50% ở nồng độ 2000 μg/ml (hoạt tính yếu) không được chọn để xác định IC50: Loại mẫu 21, 23.
Nồng độ (μM) OD (mẫu 06) L1 L2 TB HTCO% 1000 0.132 0.028 0.080 79.36 Nồng độ (μM) OD (mẫu 03) L1 L2 TB HTCO% 1000 0.198 0.178 0.188 51.50 Nồng độ (μM) OD (mẫu R-2) L1 L2 TB HTCO% 1000 0.066 0.066 0.066 82.97 2- Kết quả xác định IC50 Mẫu 06:
Bảng 1: Kết quả thử trên test MDA của mẫu 06 (chứng DMSO: 0.387).
Nồng độ
(μM) OD HTCO%
1000 0.033 91.62
500 0.114 70.59
63
100 0.243 37.44
50 0.279 28.02
10 0.335 13.71
Mẫu R-2:
Bảng 13: Kết quả thử trên test MDA não của mẫu R-2 (Chứng DMSO: 0.387)
Nồng độ (μM) OD HTCO % 1000 0.072 81.55 500 0.101 73.94 250 0.115 70.33 100 0.222 42.86 50 0.362 6.74 10 0.495 -27.57 Mẫu 3:
Bảng 14: Kết quả thử trên test MDA não của mẫu 3 (Chứng DMSO: 0.387)
Nồng độ (μM) OD HTCO% 1000 0.202 48.02 500 0.381 1.84 250 0.394 -1.64 100 0.413 -6.55 50 0.424 -9.38 10 0.479 -23.44
3. Kết quả thuốc đối chiếu
64 Trolox/MDA Nồng độ (mM) OD HTCO% 0.1 0.529 4.86 0.5 0.445 19.96 1 0.376 32.37 5 0.203 63.49 10 0.124 77.70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cheseman K.H., Studies on lipid peroxidation in normal and tumor tissues, J. Biol. Chem., 235, 507–514, 1985.
2. Stroev E. A., Makarova V. G., Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory. In: Manual in Biochemistry, Moscow, 243 -256, 1989.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 10 năm 2012 Trung tâm Sâm và Dược Liệu TP.HCM Người thực hiện
Phó Giám Đốc
PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương Th.S Trần Mỹ Tiên
Phụ lục 7. Kế t quả thử hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid (thử nghiệm MDA)
Lưu ý:
- Mẫu 03 (GV-2); Mẫu 06 (GV-3); Mẫu R-2 (GV-5)
- Bảng kết quả chỉ trình bày kết quả thử liên quan tới đề tài nghiên cứu, các kết quả thử khác không được đưa vào do không cần thiết.
65 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ
1. Phan Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Hải, Nguyễn Trung Nhân, Trần Lê Quan, Nguyễn Thị Thanh Mai “Study of antioxidant activity of An Giang and Nghe An medicinal plants”, Tạp chí Khoa học Giáo dục Kỹ thuật, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM, 2013 (đã chấp nhận đăng).
2. Phan Thị Anh Đào, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Xuân Hải, Nguyễn Trung Nhân, Trần Lê Quan, Nguyễn Thị Thanh Mai. “Some compounds from the stem of Anogeisus acuminata (roxb. ex dc.) guill. et perr. (Combretaceae)”, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 216-220, 2012.
3. Phan Thị Anh Đào, Lê Hương Thảo, Trần Lê Quan, Nguyễn Thị Thanh Mai. “Triterpenoid saponins from the stem of nauclea orientalis (L.) (Rubiaceae)). Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 51 (5B), 85-89, 2013 (Bài báo đính chính thông tin).
THUỐC AN GIANG VÀ NGHỆ AN
STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF AN GIANG AND NGHE AN MEDICINAL PLANTS
(1)Phan Thị Anh Đào, (2)Nguyễn Xuân Hải, (2)Nguyễn Trung Nhân, (2)Trần Lê Quan, (2)Nguyễn Thị Thanh Mai
1Khoa Công nghệ Hóa và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh
2Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG-TP Hồ Chí Minh
TÓM TẮT
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của 36 mẫu cao MeOH trích ly từ 36 cây thuốc An Giang và Nghệ An bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH. Trong số các mẫu cao được nghiên cứu, 23 mẫu có hoạt tính ức chế trên 50 % tại nồng độ 100 µg/ml; 15 mẫu có hoạt tính lớn hơn 50 % tại nồng độ 50 µg/ml; sáu mẫu ức chế trên 50% tại nồng độ 25 µg/ml. Năm mẫu cao có hoạt tính ức chế DPPH lớn hơn 50 % tại nồng độ 10 µg/ml. Giá trị IC50 của các mẫu này giảm dần theo thứ tự: Raphidophora aurea (2,0 µg/ml) > Punica granatum (2,3 µg/ml) > Borassus flabellifer (4,9 µg/ml) > Gossampinus (8,8) > Nauclea orientalis (9,4 µg/ml). Những mẫu cây này thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh và sẽ là tiềm năng cho các nghiên cứu phân lập hoạt chất kháng oxy hóa về sau.
Từ khóa: Cây thuốc An Giang, cây thuốc Nghệ An, hoạt tính kháng oxy hóa, DPPH
ABSTRACT
36 extracts prepared from 36 medicinal plants from An Giang province and Nghe An province were studied on antioxidant activity by the DPPH radical scavenging test. Among of extracts, 25 showed an inhibition rate over 50% at 100 µg/ml; 15 had greater than 50% inhibition at 50 µg/ml; six showed over 50% inhibition at 25 µg/ml. Five MeOH extracts exhibited strong DPPH inhibitory activity with possessing more than 50% inhibition at 10 µg/ml. The IC50 values of these extracts were found to be decreasing in the order: Raphidophora aurea (2.0 µg/ml) > Punica granatum (2.3 µg/ml) > Borassus flabellifer (4.9 µg/ml) > Gossampinus (8.8 µg/ml) > Nauclea orientalis (9.4 µg/ml). The results indicate a number of medicinal plants that may be useful for the treatment of diseases relating free radical damages, and provide the