Enzym là các thụ thể sinh học được sử dụng phổ biến nhất trong sinh học. Các xét nghiệm enzym chủ yếu dựa trên sự ức chế hoạt động của enzym hoặc xúc tác. Trong thiết kế sinh học xác định thuốc trừ sâu và cảm biến sinh học sử dụng nhiều loại enzym như organophotphative hydrolaza, kiềm photphataza, ascorbat oxyaza, tyrosinaza và axid photsphataza.[139]
Ứng dụng phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗ trợ của enzym, định lượng ure bằng enzym ureaza. Bên cạnh đó, enzym còn được dùng làm thuốc, chẳng hạn như sử dụng protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein; sử dụng amylase phối hợp với coenzym A, cytochrome C, ATP,
carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzym thủy phân để chữa bệnh thiếu enzym tiêu hóa.[140,141]
Trong thực tế enzym tác dụng với chất nền tạo thành phức chất enzym-chất nền (E-S). Phức chất này sắp xếp lại các phân tử của chất nền để tạo thành sản phẩm phản ứng (P) và sau đó lại giải phóng enzym để rồi lượng enzym vừa được giải phóng ấy lại xúc tác cho phản ứng tiếp theo. Khi nồng độ của chất nền cao thì lượng sản phẩm phản ứng được tạo ra sẽ tỷ lệ với thời gian vì khi đó toàn bộ lượng enzym sẽ phải tạo phức và không còn enzym thừa nữa mà enzym chỉ được giải phóng khi phức bị tách ra thành sản phẩm. Enzym vừa được giải phóng này sẽ lại xúc tác cho phản ứng hoá học khác.
Như vậy thực chất enzym không phải là nhân tố trực tiếp tham gia vào quá trình phản ứng mà nó chỉ đóng vai trò là chất xúc tác cho quá trình phản ứng.
Do enzym có cảm ứng cao đối với nhiệt độ, pH và những thay đổi khác của môi trường. Một trong số những ứng dụng là dùng chế phẩm enzym làm chất mang để gắn phức hợp enzym xúc tác cho phản ứng nhiều bước trong quy trình tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormon cũng như sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid. Enzym cũng được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc hóa học như: dùng enzyme protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng enzym endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid. Ngoài ra, enzym còn được dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích. [140]
Để nhận biết ure, cảm biến sinh học và điện cực chuẩn được nhúng vào trong dung dịch chất đệm có chứa ure. Ure trong dung dịch phân tích sẽ khuếch tán đến lớp màng enzym trên bề mặt cảm biến. Phản ứng thủy phân của ure được xúc tác bởi enzyme cố định trên bề mặt của cảm biến. Sản phẩm của phản ứng là những ion tích điện hoặc không tích điện được khuếch tán vào dung dịch và có thể thêm các phản ứng khác. Các ion được hình thành trong các phản ứng sẽ làm tăng độ dẫn của dung dịch ở bề mặt cảm biến. Sự thay đổi này được nhận biết bởi thiết bị cảm biến sinh học.
Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tốc độ của phản ứng thủy phân urê được xúc tác bởi enzym ureaza phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, thành phần chất đệm.
Các chứng minh cũng chỉ ra rằng sản phẩm đầu tiên của phản ứng xúc tác enzym là amoni cacbamat:
(NH2)2CO + H2O → H2NCOO− + NH4+ Sau đó cacbamat chuyển thành NH3 và CO2
H2NCOO− + H+ → NH3 + CO2 Tiếp theo là sự hòa tan CO2 sinh ra
CO2 + H2O → H2CO3
Sản phẩm của phản ứng là các axít yếu và bazo yếu. Và cuối cùng các phản ứng phụ xảy ra trong dung dịch tạo ra các ion và khuếch tán đến bề mặt cảm biến:
NH3 + H2O → NH4+ + OHH2CO3 → H− + + HCO3−
HCO3− → H+ + CO32−
Các ion của các phản ứng này sẽ được thiết bị cảm biến sinh học nhận biết chuyển thành tín hiệu điện rồi đưa ra đầu ra.
Hình 1.14: Cơ chế nhận biết ure ở bề mặt cảm biến sinh học 1.5. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu
Căn cứ nội dung tổng quan đã trình bày trong các phần trên, nghiên cứu của luận án nhằm mục tiêu chế tạo điện cực biến tính đo chọn lọc UA, ure trên cơ sở biến tính điện cực GCE để đạt được các yêu cầu sau:
-Đạt giới hạn định lượng thấp, khoảng tuyến tính dài đối với UA và ure. - Độ chọn lọc cao để có thể xác định UA, ure khi có mặt đồng thời các chất khác. Trong đó, đối với UA chất ảnh hưởng quan trọng đặc biệt quan tâm là DA và AA.
- Độ ổn định và độ lặp lại tốt của tín hiệu giữa các lần đo với độ lệch chuẩn của tín hiệu nhỏ.
- Cảm biến phù hợp ứng dụng phân tích mẫu sinh học là mẫu nước tiểu, mẫu huyết thanh hoặc dịch sinh học.
Phát triển một công cụ phân tích nhanh, nhạy và chọn lọc hàm lượng UA, ure trong mẫu huyết thanh là nhu cầu thiết yếu trong lĩnh vực phân tích lâm sàng. Do vậy đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao. Đồng thời thành công trong nghiên cứu vật liệu biến tính để xác định UA, ure với độ nhạy và độ chọn lọc cao góp phần phát triển lĩnh vực phân tích điện hóa hiện đại ở nước ta.
1.6. Kết luận
- Chỉ số UA, ure trong máu là những thông số quan trọng để chuẩn đoán bệnh gút và các bệnh về thận. Để chuẩn đoán các căn bệnh này, trong y học rất cần có các công cụ và thiết bị chính xác để phân tích UA, ure trong các mẫu sinh học cũng như xác định trực tiếp trên cơ thể.
- UA, ure có thể được phân tích bằng nhiều phương pháp khác nhau như đo quang, enzym, HPLC và phương pháp điện hóa. Trong đó do UA, ure có tính chất điện hoạt cao nên phương pháp điện hóa có nhiều thuận lợi. Đặc biệt hướng nghiên cứu chế tạo và thu nhỏ cảm biến điện hóa có nhiều triển vọng nhất với các điện cực biến tính là bộ phận quyết định. Tuy nhiên, để đi đến thành công cần vượt qua những trở ngại của phương pháp bao gồm: Ảnh hưởng của các chất có mặt đồng thời với UA trong mẫu sinh học như AA, DA. UA và các chất này có thế oxi hóa rất gần nhau nên phân tích điện hóa không đạt được tính chọn lọc. Các sản phẩm oxi hóa của các chất này hấp thụ hoặc bị polyme hóa điện hóa lên bề mặt điện cực làm giảm hiệu năng của điện cực.
- Các cảm biến xác định UA, ure trực tiếp đòi hỏi phải nhạy, đo nhanh, chọn lọc. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học vật liệu, các nhà khoa học đã ứng
dụng nhiều loại vật liệu khác nhau để chế tạo các điện cực biến tính xác định đồng thời hoặc chọn lọc UA, ure trong sự có mặt của các yếu tố ảnh hưởng khác. Những loại vật liệu được đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây gồm cacbon dạng ống nano, Gr, hạt nano kim loại hoặc oxit kim loại, vật liệu polyme dẫn hoặc compozit, các ion lỏng.
- Hướng nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính để xác định UA, ure một cách nhanh, nhạy, chọn lọc và tương thích sinh học là đề tài nghiên cứu rất được quan tâm. Trên thế giới, các nhóm nghiên cứu tuy đã đạt được nhiều kết quả quan trọng nhưng để có được những sản phẩm trực tiếp phục vụ trong lĩnh vực y học vẫn còn rất nhiều mục tiêu phải đầu tư nghiên cứu để vượt qua. Vì vậy, rất nhiều các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu và tìm kiếm những giải pháp ưu việt. Qua tổng quan cho thấy sự quan tâm và triển vọng của hướng nghiên cứu vẫn không ngừng tăng lên.
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu của luận án là chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở lựa chọn tối ưu các loại vật liệu nhạy và chọn lọc với ure và UA. Trong hướng nghiên cứu này, vấn đề đặt ra là phải có căn cứ khoa học biến tính điện cực GCE thông thường để xác định chọn lọc ure, UA và các thành phần phổ biến trong môi trường mẫu huyết thanh. Thông qua tổng quan nghiên cứu tài liệu, luận án trình bày các kết quả thực tế đã đạt được với từng bước phát triển thống nhất đi đến giải quyết trọn vẹn vấn đề được đặt ra và được giải quyết như sau:
1. Nghiên cứu chế tạo điện cực đo UA
- Chế tạo điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs và điện cực GCE/rGO/PDA- Cu/CuNPs
-Nghiên cứu ảnh hưởng của Gr, rGO trên điện cực GCE. -Nghiên cứu các điều kiện tổng hợp tối ưu PDA-Cu(II)
-Nghiên cứu tổng hợp CuNPs lên điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II).
- Đánh giá đặc trưng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs, GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điện cực.
2. Nghiên cứu chế tạo điện cực đo ure
* Nghiên cứu chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza -Nghiên cứu đặc tính của graphen tổng hợp
-Nghiên cứu chế tạo và khảo sát các đặc trưng của điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza 3. Các điện cực đã biến tính thành công được ứng dụng phân tích mẫu thực tế. Kết quả phân tích mẫu được so sánh với kết quả của đơn vị thử nghiệm chuyên nghiệp. Kết quả phân tích mẫu nước tiểu được thêm bổ sung chất chuẩn UA, ure được đánh giá độ thu hồi và so sánh với kết quả của bệnh viện…..
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị nghiên cứu điện hóa đa năng Autolab (AUT30.v AUTOLAB, Eco Chemie B.V., Hà Lan).
- Điện cực so sánh Ag/AgCE1(KCl 3M), điện cực đối Pt và điện cực làm việc GCE có đường kính 2mm (6.1204.110GCE, Metrohm- Thụy Sỹ).
- Thiết bị quang phổ Raman Jasco NRS- 3000 Series, bước sóng kích thích laze 532nm và mật độ cong suất 2.9 mW/cm2.
- Thiết bị hiển vi điện tử quét phát xạ trường (field-emission scanning electron microscope – FE - SEM, JSM – 6700, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
-Vi điện cực tích hợp Dropsens (Hà Lan): đường kính điện cực làm việc là 1,6 mm. 2.1.2. Hóa chất
-Các hóa chất gồm Gr, graphit, UA, ure, DA, AA, hãng sản xuất Sigma (Đức). - Di-Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) hãng sản xuất Prolabo (Pháp). Natri dihydrogen phosphat monohydrat (NaH2PO4.H2O) hãng sản xuất Merck (Đức). Dung dịch đệm 0,1 M (PBS), pH 7,0, được điều chế từ Na2HPO4.2H2O và NaH2PO4.2H2O
- CuCl2, axid sulfuric (H2SO4), axid clohydric (HCl), amoniac (NH4OH), etanol, hydro peoxit (H2O2), natrinitorit (NaNO2), hãng sản xuất Merck, Đức.
-Enzym ureaza (E.C.3.5.1.5, 42 đơn vị/mg, Sigma - Aldrich)
- Dung dịch Pyrol của hãng Fluka (Thụy Sĩ) đã được cất trước khi sử dụng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC.
-Tất cả các hóa chất được chuẩn bị bằng nước deion. 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
2.1.3.1. Các phương pháp nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực
Để nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực, các kỹ thuật đã được sử dụng trong luận án này gồm: Von-ampe vòng (CV), hiển vi điện tử quét (SEM), phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX), Von - Ampe xung vi phân (DPV)
* Phương pháp von-ampe vòng (CV)
CV là phương pháp được áp dụng rất phổ biến trong nghiên cứu điện hóa giúp thu được nhiều thông tin hữu ích về các phản ứng và quá trình điện hóa. Ưu điểm của phương pháp là giúp nhận định nhanh chóng bản chất nhiệt động của của quá trình oxi hóa khử và động học của phản ứng trao đổi điện tử giữa hai chất là chất oxi hóa và chất khử hay giữa quá trình hấp phụ. CV giúp xác định nhanh chóng vị trí điện thế mà tại đó chất điện hoạt bị oxi hóa hoặc khử hoặc ảnh hưởng của môi trường đo đến quá trình oxi hóa khử.
Trong luận án này, phương pháp CV được thực hiện trên hệ thiết bị nghiên cứu điện hóa đa năng Autolab (AUT30.v AUTOLAB, Eco Chemie B.V., Hà Lan). Hệ đo gồm 3 điện cực là điện cực so sánh Ag/AgCl (KCl 3M), điện cực đối Pt và điện cực làm việc. Điện cực làm việc là glasy cacbon (GCE) có đường kính 2mm (Metrohm-Thụy sỹ), không biến tính hoặc biến tính.
Các khoảng quét thế được khảo sát lựa chọn để nghiên cứu các phản ứng điện hóa tùy thuộc vào đặc trưng bề mặt điện cực làm việc và bản chất điện hóa của chất điện hoạt. Ngoài ra, căn cứ mục đích nghiên cứu, số vòng quét, tốc độ quét được khảo sát và lựa chọn phù hợp.
*Phương pháp von-ampe xung vi phân
Các kỹ thuật DPV được áp dụng nhằm hạ thấp giới hạn phát hiện nhờ tăng tỷ kệ dòng faraday so với dòng phi faraday. Nhờ các kỹ thuật áp thế dạng xung, các thiết bị hiện đại ngày nay có thể hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp von- ampe đến 10-8 M. Kỹ thuật DPV là kỹ thuật hiện đại thuộc nhóm các phương pháp kiểm soát điện thế và đo dòng faraday. Bằng kỹ thuật này, dòng faraday sinh ra do quá trình oxi hóa khử các chất điện hoạt được đo chính xác và tách khỏi dòng phi faraday sinh ra do lớp điện kép giữa bề mặt điện cực và dung dịch (còn gọi là dòng tụ điện). Trong Phương pháp von-ampe xung vi phân, điện cực làm việc được áp thế một chiều biến thiên theo thời gian với tốc độ chậm (1-2 mV/s), các xung 10- 100 mV được đặt vào trong quá trình áp thế. Dòng điện được đo tại hai thời điểm ngay trước khi áp xung và trước khi hết xung. Hiệu của cường độ dòng tại hai thời điểm là i it 2
it1
được biểu diễn theo biến thiên điện thế thu được đồ thị DPV dạng pic tín hiệu. Chiều cao pic tín hiệu trên đồ thị DPV tỷ lệ trực tiếp nồng độ chất điện hoạt trong dung dịch đo. [142]
Các thông số cần đặt khi thực hiện phép đo DPV gồm: Khoảng quét thế, bước thế (step potential), cường độ xung (modulation amplitude), thời gian áp xung (modulation time) và chu kỳ áp xung (interval time).
* Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM)
SEM là một loại kính hiển vi điện tử sử dụng để nghiên cứu hình thái bề mặt của mẫu. Đây là thiết bị dùng để chụp ảnh vi cấu trúc bề mặt với độ phóng đại lớn
gấp nhiều lần so với kính hiển vi quang học. Độ phóng đại của SEM nằm trong một dải rộng từ 10 đến 1 triệu lần (trong khi kính hiển vi quang học chỉ có độ phóng đại từ 1 đến 10000 lần). Độ phân giải của SEM khoảng vài nanomet trong khi của kính hiển vi quang học là vài mircomet. Ngoài ra SEM còn cho độ sâu trường ảnh lớn hơn so với kính hiển vi quang học. Mẫu dùng để quan sát bằng SEM phải được xử lý bề mặt và thao tác của SEM là ở trong chân không. Ưu điểm của phương pháp SEM là có thể thu được những bước ảnh 3 chiều rõ nét và đòi hỏi phức tạp trong khâu chuẩn bị mẫu.
Trong thiết bị SEM, điện tử được sử dụng thay cho ánh sáng trong kính hiển vị quang học. Điện tử được phóng ra từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt hoặc phát xạ trường...), sau đó được tăng tốc với thế tăng tốc từ 10kV đến 50kV. Chùm điện tử phát ra (chùm điện tử sơ cấp) được đưa đi qua hệ thấu kính và lăng kính sau đó được điều khiển để quét trên một bề mặt rất nhỏ của mẫu. Sau đó, các tín hiệu được phát ra do tương tác của điện tử sơ cấp với mẫu - được gọi là các tín hiệu thứ cấp được ghi nhận và phân tích. Các tín hiệu này bao gồm: điện tử thứ cấp (1), chùm điện tử tán xạ ngược (2), điện tử tán xạ không đàn hồi (3), điện tử tán xạ đàn hồi (4), điện tử hấp thụ (5), điện tử Auger (6) và tia X (7). Các tín hiệu (1, 2, 5, 6, 7) được sử dụng trong SEM. Căn cứ vào các thông tin thu được bởi ống đếm từ các tín hiệu trên, người ta có thể dựng lại hình thái bề mặt của mẫu một cách chính xác.
Các lớp vât liệu biến tính bề mặt điện cực thực hiện trong luận án này được chụp ảnh SEM để so sánh sự khác biệt khi vật liệu hình thành hoặc biến đổi.
*. Phương pháp Phổ tán sắc năng lượng
Phổ tán sắc năng lượng là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn