3.3.2.
Hình thái của bề mặt tấm Cu sau quá trình CVD được thể hiện trên hình 3.29. Một số sọc trắng (được chỉ bằng mũi tên) do sự hiện diện của Gr trên lá Cu sau CVD. Sự xuất hiện của các sọc trắng này do sự khác biệt giữa hệ số giãn nở nhiệt của Gr (αGr = - 6.10-6 / K) và chất nền Cu (αCu = 24.10-6 / K) [149].
Hình 3.29: Ảnh SEM bề mặt của màng graphen trên đế đồng được tổng hợp bằng phương pháp CVD nhiệt
Chất lượng và đặc tính của graphen được nghiên cứu sâu hơn bằng quang phổ Raman (hình 3.30). Các đỉnh cụ thể của Gr được quan sát chi tiết: Đỉnh D ở 1353 cm-1, là do chế độ giãn nở ngoài mặt phẳng của các nguyên tử sp2. Đỉnh G ở 1582 cm-1 do cấu trúc than chì và đỉnh 2D (~2683 cm-1) tương ứng với cấu trúc Gr. Cường độ cao của đỉnh 2D chứng tỏ rằng màng Gr tổng hợp có chất lượng tốt. Số lượng lớp Gr trên màng cũng có thể được dự đoán từ phổ Raman do tỷ lệ cường độ của băng 2D so với băng G của Gr phụ thuộc vào số lượng lớp Gr [150]. Nếu tỷ lệ I2D/IG ~ 2-3, đặc trưng Gr đơn lớp; nếu 2> I2D/IG> 1, đặc trưng cho Gr 2 lớp; và nếu I2D/IG <1, đặc trưng cho Gr đa lớp. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ I2D/IG thu được là 1,14, cho thấy màng Gr phát triển trên đế Cu có cấu trúc đa lớp.
Số lượng các lớp graphen cũng được xác định bởi HRTEM (Hình 3.30B). Kết quả cho thấy màng Gr tổng hợp là Gr đa lớp với số lượng lớp dao động từ 2 đến 3 lớp. Khoảng cách giữa hai lớp graphen xấp xỉ 0,34nm. Kết quả này phù hợp tốt với kết quả đo phổ Raman.
(A) (B)
Hình 3.30: (A) Phổ Raman và (B) hình ảnh HRTEM của màng Gr tổng hợp 3.3.3. Chế tạo vi điện cực Pt/Gr/ PANi/Ureaza
3.3.2.1. Tổng hợp điện hóa màng PANi trên vi điện cực tích hợp dropsens
Các màng PANi đã được lắng đọng điện hóa trên các vi điện cực bạch kim trần và các vi điện cực bạch kim được biến tính Gr bằng cách sử dụng phương pháp quét CV, 20 chu kỳ, điện thế từ -0,4 V đến + 0,9 V (so với Ag/AgCl), tốc độ quét
50 mV/s, dung dịch điện hóa monome anilin 0,3 M và H2SO4 0,5 M. Hình 3.31 thể hiện các đường cong CV của phản ứng trùng hợp điện hóa của monome anilin trên vi điện cực bạch kim trần (Hình 3.31a) và trên các vi điện cực platin biến tính (Hình 3.31b). 300 250 200 150 100 50 0 -50 -100 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 E ( V ) 600 500 400 300 200 100 0 -100 -200 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E (V)
Hình 3.31: Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng PANi trên điện cực Pt (a) và trên điện cực Pt gắn màng Gr (b)
Tín hiệu cường độ dòng khi có gắn màng Gr (b) tăng gần 2 lần so với khi không có màng Gr (a), chứng tỏ sự có mặt của màng Gr đã cải thiện đáng kể độ dẫn điện của bề mặt điện cực (gia tăng diện tích bề mặt điện hoá).
3.3.2.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu*Ảnh hưởng của pH *Ảnh hưởng của pH 60000 4000 I (A) 40000 20000 0 I (A) 3000 2000 1000 0 -20000 -40000 -60000 -600 -400 -200 0 200 400 600 E/V -1000 -2000 -3000 -4000 -600 -400 -200 0 200 400 600 E /V (A) (B) I ( ) I ( ) (a) (b) pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11 e c a d b pH 7 pH 9 pH 11 c d e
(C)
Hình 3.32: Phổ CV (A, B) và đồ thị (C) khảo sát sự ảnh hưởng của pH tới cường độ dòng Kết quả cho thấy trong môi trường axit (pH<7), cường độ dòng quá cao. Điều
này dẫn đến cấu trúc của màng tổng hợp không đồng đều, ổn định. Trong môi trường trung tính và bazo (pH>7), cường độ dòng thấp, ổn định hơn, thuận lợi cho việc tổng hợp. Do đó chúng tôi tiến hành tổng hợp màng trong điều kiện pH trung tính (pH=7).
*Ảnh hưởng của chất đối chứng axit Ascorbic
Từ đồ thị và phổ CV hình 3.33 ta thấy axit ascorbic không ảnh hưởng đến hoạt động của enzym. Sự tăng tín hiệu cường độ dòng điện thu được là do sự tăng nồng độ ion H+ (do axit ascorbic giải phóng), phù hợp với kết quả nghiên cứu ảnh ảnh của pH. I (A) d 8000 b 6000 a 4000 2000 0 -2000 -600 -400 -200 0 200 400 600 E/V (A) (B)
Hình 3.33: Phổ CV (A) và (B) đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của chất đối chứng axit ascorbic I (µ A) I( µ A) pH c 2 mM 6 mM 10 mM 15 mM a b c d Caxit L-ascorbic(mM)
3.3.4. Kết quả phân tích hàm lượng UA sử dụng điện cực biến tính Pt/Gr/ PANi/Ureaza
(A) (B)
Hình 3.34: (A) phổ CV và (B) đường biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ urê vào cường độ dòng.
Kết quả cho thấy cảm biến sinh học trên cơ sở màng Gr/PANi có đáp ứng tuyến tính với nồng độ urê trong khoảng từ 5 - 30mM. Khi nồng độ urê lớn hơn 30mM, cường độ dòng điện cũng tăng không đáng kể.
Bảng 3.21: Kết quả đo cường độ dòng của dung dich ure 2mM
Lần đo 1 2 3 4 5 �̅
I(µ�) 0,12 0,11 0,12 0,10 0,13 0,116
Từ kết quả bảng 3.21 được phương trình hồi quy có dạng I (A) =0,11553 + 0,0198*C (mg/mL). Hệ số tương quan của phương trình hồi quy đạt 0,96948.
LOD = 1,59.10-3 (mM); LOQ = 5,3.10-3 (mM).
I (µ A)
Bảng 3.22: Bảng giá trị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch ure và tín hiệu dòng đo được I(µA) Nồng độ (mM) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 �̅ ̅̅�̅̅�̅�̅ R%= 2 0,12 0,11 0,12 0,10 0,13 0,116 1,92 96% 4 0,18 0,16 0,18 0,16 0,17 0,17 3,84 96% 6 0,25 0,26 0,24 0,25 0,24 0,248 5,94 99% 8 0,30 0,29 0,30 0,30 0,31 0,30 8,12 101%
Từ kết quả thu được ta thấy cảm biến sinh học trên cơ sở màng Gr/PANi có nhiều tiềm năng trong trong phân tích nhanh hàm lượng ure.
3.3.5. Kết luận
Trong phần này, chúng tôi đã trình bày qui trình chế tạo điện cực Pt/Gr/ PANi/Ureaza bằng cách tổng hợp Gr bằng phương pháp CVD sau đó tách và gắn màng Gr lên vi điện cực droppsens. Đặc tính của Gr được đánh giá bằng ảnh SEM, TEM và phổ Raman. Kết quả cho thấy màng Gr tổng hợp là Gr đa lớp với số lượng lớp 2-3. Tổng hợp điện hóa màng PANi lên vi điện cực phủ màng Gr bằng cách quét CV trong dung dịch 0,3 M monome anilin và H2SO4 0,5M và được ổn định trong dung dịch HCl 0,1 M bằng cách quét thế vòng đa chu kỳ. Enzym được cố định trên điện cực và ủ trong hơi glutaraldehit 25% trong 24 giờ, làm khô trong không khí ở nhiệt độ thường. Điện cực Pt/Gr/ PANi/Ureaza sau khi chế tạo xong được khảo sát các điều kiện tối ưu nhất để xác định urê như pH 7, khoảng tuyến tính 5.10-3 – 30.10-3 (mol/L); LOD = 1,59.10-6 (mol/L); LOQ = 5,3.10-6 (mol/L).
3.5. Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực tế
Điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs, GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs được ứng dụng làm điện cực làm việc để phân tích hàm lượng UA, Pt/Gr/ PANi/Ureaza được sử dụng phân tích hàm lượng Ure trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp thêm chuẩn. Tất cả các kết quả được đối chiếu, so sánh với kết quả từ 1 đơn vị phân tích độc lập, có nhiều kinh nghiệm trong phân tích các mẫu nước tiêu. Kết quả chi
tiết được thể hiện trong bảng 3.23. Kết quả cho thấy việc sử dụng các điện cực cảm biến trong luận án cho kết quả tương đối sát với mẫu phân tích đối chứng tại đơn vị độc lập (sai số tối đa dưới 4%), chứng tỏ rằng các kết quả nghiên cứu có độ tin cậy cao. Các điện cực cảm biến trong luận án có nhiều tiềm năng để phát triển ứng dụng trong thực tế
Bảng 3.23: Phân tích mẫu nước tiểu với các điện cực cảm biến
STT Điện cực Chỉ tiêu phân tích Kết quả đối chứng (mM) kết quả đo được được(mM) Sai khác tương đối (%) 1 GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs UA 1,89 1,92 (n=5) 1,56 2 GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs UA 1,89 1,96 (n=5) 3,57 3 Pt/Gr/ PANi/Ureaza Ure 350,8 347,6 (n=5) 0,92
KẾT LUẬN
Từ những nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, các kết quả nghiên cứu chính đã đạt được như sau:
a) Đã xây dựng qui trình tối ưu và chế tạo thành công ba loại điện cực biến tính dùng để phân tích nhạy và chọn lọc đối với UA, Ure trong mẫu nước tiểu gồm: (1) điện cực biến tính GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs chế tạo bằng vật liệu Gr với PDA-Cu và hạt nano đồng; (2) điện cực biến tính GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs chế tạo bằng vật liệu GO với PDA-Cu và hạt nano đồng; (3) điện cực biến tính Pt/Gr/ PANi/Ureaza chế tạo bằng vật liệu Gr với polyanilin và enzym ureaza.
Đã ứng dụng các điện cực biến tính chế tạo đươc để xác định UA và ure trong mẫu nước tiểu 24 giờ cho kết quả có độ chính xác cao.
Những loại vật liệu như Gr, GO, hạt nano kim loại, polyme dẫn là những vật liệu có nhiều ưu điểm và có tính chất lý hóa ưu việt nhưng khó tích hợp trên các loại bề mặt cảm biến. Trong luận án này, các loại vật liệu trên đã được nghiên cứu và ứng dung thành công vào mục đích đề ra trong chế tạo điện cực biến tính xác định UA và ure. Trong các qui trình chế tạo điện cực biến tính, cơ sở của các tính chất và cơ chế lý hóa của từng loại vật liệu đã được khảo sát và biện luận, giải thích
b) Đã chế tạo thành công điện cực biến tính GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs có độ nhạy và độ chọn lọc cao với axit uric. Khoảng tuyến tính của điện cực là 1,19.10- 5 – 3,46.10-4(mol/L), LOD = 8,142.10-7(mol/L), LOQ = 2,71.10-6 (mol/L), điện cực có độ lặp lại và độ ổn định tín hiệu tốt.
Đã chế tạo thành công điện cực biến tính GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs có độ nhạy và độ chọn lọc cao với axit uric. Điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs sau khi chế tạo xong được khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện để đo UA tốt nhất như pH 7, khoảng tuyến tính 1,19.10-5 – 2,24.10-4 (mol/L), LOD = 3,9 .10-6(mol/L). Điện cực sau khi chế tạo được ngâm trong đệm để qua đêm đáp ứng với UA tốt hơn, độ ổn định cao hơn điện cực vừa mới chế tạo và điện cực đo ở ngày thứ 3.
Đã chế tạo thành công điện cực Pt/Gr/ PANi/Ureaza với các điều kiện tối ưu để xác định ure như pH 7, khoảng tuyến tính 5.10-3 – 30.10-3 (mol/L); LOD = 1,59.10-6 (mol/L); LOQ = 5,3.10-6 (mol/L).
c) Đã ứng dụng các điện cực biến tính chế tạo được để phân tích mẫu nước tiểu. Kết quả thu được có độ tin cậy cao được đối chứng bằng kết quả thử nghiệm song song của một đơn vị dịch vụ đôc lập. Cho phép kết luận rằng điện cực biến tính đã chế tạo thành công để ứng dụng phân tích mẫu nước tiểu.
Thành công của luận án là một đóng góp có giá trị về mặt ứng dụng vật liệu mới trong nghiên cứu điện hóa để phân tích đối tượng mẫu y sinh.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Bui Thi Phuong Thao, Duong Thu Ha, Nguyen Le Huy, Do Phuc Quan, Tran Dai Lam. Electrochemical determination of Uric acid based on polydopamine - Copper/ Graphene (Gr-PDA-Cu). The 6th Analytica Vietnam Conference 2019 page 292 – 303
2. Nguyen Hai Binh, Bui Thi Phuong Thao, Cao Thi Thanh, Nguyen Van Quynh, Bui Dinh Tu, Tran Dai Lam, Nguyen Van Chuc, Do Phuc Quan. A hybrid film of Graphene/Polyaniline/Urease based electrochemical biosensor for the rapid determination of herbicide atrazine. The 6th Analytica Vietnam Conference 2019 page 119-125
3. Do Phuc Quan; Bui Thi Phuong Thao;Nguyen Van Trang; Nguyen Le Huy;
Nguyen Quoc Dung; ; Minhaz Uddin Ahmed,Tran Dai Lam, The role of copper
nanoparticles decorating polydopamine/graphene film as catalyst in the enhancement of uric acid sensing. Journal of Electroanalytical Chemistryjournal,
Journal of Electroanalytical Chemistryjournal Volume 893, 15 July 2021, 115322
4. Bùi Thị Phương Thảo, Dương Thu Hà, Đỗ Phúc Quân, Trần Đại Lâm.
Nghiên cứu xác định chọn lọc điện hóa axit uric trên điện cực biến tính nano compozit rGO/PDA-Cu/CuNPs. Tạp chí Khoa học và công nghệ Việt Nam tập 61, số 1 tháng 1/2019 trang 37-42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Johnson R. J., Kang D.-H., Feig D., et al. Is there a pathogenetic role for uric acid in hypertension and cardiovascular and renal disease? Hypertension. 2003;41(6):1183–1190.
2. Abellán-Llobregat A., Vidal L., Rodríguez-Amaro R., Berenguer-Murcia Á., Canals A., Morallón E. Au-IDA microelectrodes modified with Au-doped graphene oxide for the simultaneous determination of uric acid and ascorbic acid in urine samples. Electrochimica Acta. 2017; 227:275–284.
3. Mazzali M., Hughes J., Kim Y.-G., et al. Elevated uric acid increases blood pressure in the rat by a novel crystal-independent mechanism. Hypertension. 2001;38(5):1101–1106.
4. Kutzing M. K., Firestein B. L. Altered uric acid levels and disease states. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2008;324(1):1–7. 5. George S. K., Dipu M. T., Mehra U. R., Singh P., Verma A. K., Ramgaokar J.
S. Improved HPLC method for the simultaneous determination of allantoin, uric acid and creatinine in cattle urine. Journal of Chromatography B. 2006;832(1):134–137. doi: 10.1016/j.jchromb.2005.10.051.
6. Muñoz J. A., López-Mesas M., Valiente M. Development and validation of a simple determination of urine metabolites (oxalate, citrate, uric acid and creatinine) by capillary zone electrophoresis. Talanta. 2010;81(1-2):392–397. 7. Kwon W., Kim J. Y., Suh S., In M. K. Simultaneous determination of
creatinine and uric acid in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with polarity switching electrospray ionization. Forensic Science International. 2012; 221(1-3): p 57–64.
8. Miyake M., Shibukawa A., Nakagawa T. Simultaneous determination of creatinine and uric acid in human plasma and urine by micellar electrokinetic chromatography. Journal of Separation Science; 1991; 14(3): p181–185.
9. A.J. Bard, L.R. Faulkner, Electrochemical methods: fundamentals and applications: Wiley New York; 1980
10. K. Pramoda, K. Moses, U. Maitra, C. Rao, Superior performance of a MoS2 – RGO composite and a borocarbonitride in the electrochemical detection of dopamine, uric acid and adenine, Electroanalysis; 2015; 27(8) p 1892-1898 11. X. Cai, K. Kalcher, C. Neuhold, B. Ogorevc, An improved voltammetric
method for the determination of trace amounts of uric acid with electrochemically pretreated carbon paste electrodes, Talanta; 1994; 41(3): p.407- 413
12. J.S. Ye, Y. Wen, W. De Zhang, L.M. Gan, G.Q. Xu, F.S. Sheu, Selective voltammetric detection of uric acid in the presence of ascorbic acid at well aligned carbon nanotube electrode; Electroanalysis, 2003; 15 (21); p1693-1698. 13. J.M. Zen, P.J. Chen, A Selective Voltammetric Method for Uric Acid and
Dopamine Detection Using Clay-Modified Electrodes, Anal. Chem; 1997; 69 (24); p5087-5093
14. E. Popa, Y. Kubota, D.A. Tryk, A, Selective voltammetric and amperometric
detection of uric acid with oxidized diamond film electrodes; Anal.
Chem; 2000; 72(7); p1724-1727
15. S.B. Khoo, F. Chen, Studies of Sol−Gel Ceramic Film Incorporating Methylene Blue on Glassy Carbon: An Electrocatalytic System for the Simultaneous Determination of Ascorbic and Uric Acids, Anal. Chem; 2002; 74 (22) p.5734-5741.
16. J.C. Ndamanisha, L. Guo, Electrochemical determination of uric acid at ordered mesoporous carbon functionalized with ferrocenecarboxylic acid- modified electrode, Biosensors and Bioelectronics, 2008; 23(11); P.1680-1685 17. S. Wu, T. Wang, Z. Gao, H. Xu, B. Zhou, C. Wang, Selective detection of uric
acid in the presence of ascorbic acid at physiological pH by using a β- cyclodextrin modified copolymer of sulfanilic acid and N-acetylaniline,
Biosensors and Bioelectronics ; 2008; 23(12), p.1776-1780
18. A. Özcan, Y. Şahin, Preparation of selective and sensitive electrochemically treated pencil graphite electrodes for the determination of uric acid in urine and blood serum, Biosensors and Bioelectronics; 2010; 25(11), p. 2497-2502
19. S.A. Kumar, H.W. Cheng, S.M. Chen, Selective Detection of Uric Acid in the Presence of Ascorbic Acid and Dopamine Using Polymerized Luminol Film Modified Glassy Carbon Electrode, Electroanalysis 2009, 21(20), p.2281 – 2286 20. Z.-H. Sheng, X.-Q. Zheng, J.-Y. Xu, W.-J. Bao, F.-B. Wang, X.-H. Xia,
Electrochemical sensor based on nitrogen doped graphene: simultaneous determination of ascorbic acid, dopamine and uric acid, Biosens Bioelectron. 2012; 34(1), p.125-131
21. . C.-L. Sun, H.-H. Lee, J.-M. Yang, C.-C. Wu, The simultaneous electrochemical detection of ascorbic acid, dopamine, and uric acid using graphene/size-selected Pt nanocomposites, Biosens Bioelectron, 2011 ; 26(8), p.3450-3455.
22. F. Mizutani, S. Yabuki, Y. Sato, T. Sawaguchi, S. Iijima, Amperometric determination of pyruvate, phosphate and urea using enzyme electrodes based