Sau khi chế tạo, các điện cực biến tính được ứng dụng phân tích mẫu. Kỹ thuật đo được áp dụng là xung vi phân, định lượng nồng độ UA, ure theo phương pháp thêm chuẩn.
Độ chính xác gồm độ chụm và độ đúng của kết quả thử nghiệm được đánh giá thông qua độ lặp lại và so sánh kết quả thử nghiệm với kết quả từ phương pháp đang đươc ứng dụng phổ biến thực tế trong các cơ sở xét nghiệm chuyên nghiệp. 2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Phân tích axit uric
2.2.1.1. Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs
Điện cực GCE được làm sạch bằng bột nhôm oxit cỡ hạt 0,3µm, sau đó rửa sạch và rung siêu âm 20s trong nước khử ion. Nhỏ 5µl Gr (Gr một lớp, từ vật liệu ACS (ACS Material) có đường kính vảy 0,4 - 5µm, độ dày 0,6 - 1,2nm và điện trở <0,3 Ω.cm, có độ phân tán cao trong nước với sự hỗ trợ của siêu âm) lên bề mặt điện cực GCE sau khi được hoạt hóa. Điện cực sau đó được để khô ở nhiệt độ phòng (khoảng 30 phút). Điện cực GCE sau khi được phủ Gr được ký hiệu GCE/Gr.
Điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs được chế tạo bằng phương pháp áp thế (CA) trong dung dịch DA 10mM, CuCl2 10mM ở thế 0,5V, thời gian là 350s sau đó điện phân CuNPs bằng cách quét CV 10 vòng trong dung dịch Cu 10mM, H2SO4
0,1M. Hai điện cực thu được tiến hành khảo sát đáp ứng với UA trong dung dịch PBS pH 7.
Để tối ưu hoá quy trình chế tạo điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát 2 phương pháp tổng hợp lớp PDA-Cu (CV và CA), thời gian
tổng hợp (300s đến 450s). Ảnh hưởng của CuNPs trong điện cực được khảo sát thông qua số vòng quét (3 đến 20 vòng).
Từ kết quả khảo sát thưc nghiệm, qui trình tối ưu chế tạo điện cực biến tính GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ quá trình khảo sát thưc nghiệm, qui trình tối ưu chế tạo điện cực biến tính/CuNPs
2.2.1.2. Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPsa. Tổng hợp điện hóa rGO a. Tổng hợp điện hóa rGO
Điện cực GCE sau khi được làm sạch sấy khô, dùng microxilanh hút 3 l
dung dịch GO 30 g / ml phủ lên bề mặt điện cực glasy cacbon, để khô ở nhiệt độ phòng. Tiến hành CV trong dung dịch NaCl 0,5M với khoảng thế -1,5 đến – 0,5V, 10 vòng, tốc độ quét là 100mV/s. Điện cực GCE sau khi được phủ lớp điện hóa lớp GO được ký hiệu là GCE/rGO.
Điện cực GCE/rGO sau khi chế tạo được phủ thêm lớp PDA–Cu theo hai phương pháp:
30mM + DA 10mM
- Phương pháp điện hóa: Điện phân trong dung dịch DA-CuCl2 bằng cách quét CV ở khoảng thế từ -0,3V đến 0,5V, tốc độ quét 10mV/s (khảo sát với 2-5 vòng quét; tỉ lệ số mol DA:CuCl2 thay đổi 1:1; 1:2; 1:3; 1:4).
Quá trình điện phân CuNPs lên bề mặt điện cực bằng cách quét CV trong dung dịch Cu 3mM + H2SO4 0,1M thực hiện trên máy Autolab/PGSTAT với số vòng điện phân khác nhau: 5 vòng, 10 vòng và 15 vòng
Hình 2.2: Sơ đồ quá trình chế tạo điện cực biến tính GC/rGO/PDA–Cu/CuNPs * Khảo sát các đặc trưng của điện cực
-Khảo sát tính chất điện hóa
Tính chất điện hóa của các điện cực được nghiên cứu bằng phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) trong dung dịch chứa K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5mM, KCl 0,1M trong khoảng thế từ -0,3V đến 0,5V; 5 vòng, tốc độ quét 100mV/s. Tính chất điện hóa thể hiện ở tín hiệu cường độ dòng của các điện cực.
Tiến hành quét CV dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5mM và KCl 0,1M với tốc độ quét khác nhau từ 10 đến 120 mV s2
-1. Diện tích bề mặt điện hoạt của điện cực được tính theo phương trình Randles – Sevcik. -pH của dung dịch đệm
Điện cực sau khi chế tạo được sử dụng để khảo sát khả năng đáp ứng của điện cực với UA trong các môi trường pH của dung dịch đệm khác nhau.
- Khảo sát khả năng đáp ứng của điện cực theo thời gian
Tiến hành khảo sát đáp ứng của các điện cực bằng kỹ thuật đo xung vi phân trên máy Autolab/PGSTAT ở khoảng thế từ -0,3 V đến +0,5 V trong dung dịch có chứa UA + PBS pH 7. Quan sát và ghi kết quả đánh giá. Điện cực sau khi đo xong được ngâm trong đệm PBS pH 7 và tiếp tục khảo sát lặp lại sau 2 đến 14 ngày chế tạo.
- Khảo sát độ chọn lọc của điện cực
Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng là DA, Glucozo, Citric, Nitrit, Paracetamol bằng cách sử dụng điện cực mới chế tạo để kiểm tra các đáp ứng của DA, Glucozo, Citric, Nitrit, Paracetamol trong dung dịch chứa UA 1,07×10-4M + PBS pH 7 bằng cách quét DPV
- Khảo sát khoảng nồng độ làm việc của điện cực
Điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs sau khi chế tạo rửa sạch và tiến hành đo khoảng tuyến tính của UA trong dung dịch PBS pH 7 trên máy Autolab/PGSTA sử dụng phương pháp quét DPV với nồng độ UA tăng dần. Từ mối quan hệ giữa cường độ tín hiệu và nồng độ UA lập đường chuẩn xác định khoảng tuyến tính.
-Độ ổn định và độ lặp lại tín hiệu của điện cực
Độ ổn định và lặp lại của tín hiệu điện cực sau quá trình sử dụng phân tích UA được khảo sát bằng cách đo UA lặp lại ở nhiều nồng độ khác nhau.
2.2.2. Phân tích ure (Điện cực Pt/ Graphen/PANi/Ureaza)
a. Chuẩn bị điện cực, chế tạo màng Gr theo phương pháp CVD
Các vi điện cực tích hợp điện hóa được chế tạo bằng công nghệ MEMS với đường kính của điện cực làm việc là 200 nm [144]
* Màng Gr được chế tạo theo phương pháp bay hơi lắng đọng hoá học (CVD)
- Cắt miếng Gr/Cu thành miếng nhỏ có kích thước bằng kích thước cần phủ lên điện cực làm việc (WE).
- Sử dụng miếng Teflon, tiến hành dùng dao dọc giấy tạo lỗ nhỏ ở giữa miếng ( lỗ nhỏ bằng miếng Gr/Cu)
-Đặt miếng Gr/Cu vào bên trong miếng Teflon( phần vừa tạo)
-Chuyển miếng Teflon chứa Gr/Cu vào khay ăn mòn chứa FeCl3 0,5M. - Sau 10 phút lớp Gr bên dưới bị tách ra, lắc nhẹ khay ăn mòn để lớp Gr bên dưới tách ra hoàn toàn.
-Chuyển qua khay ăn mòn đựng nước cất, rửa lại 3-4 lần bằng nước cất. -Chuyển vào khay ăn mòn chứa (NH4)2S2O8 0,5M.
-Khi hết Cu chuyển qua rửa lại bằng nước cất 5-6 lần.
-Rửa sạch bằng nước khử ion 3 lần, sau đó chuyển lên điện cực. -Sấy khô điện cực rồi kéo miếng Teflon ra
-Ủ điện cực ở 600C trong khí Ar.
* ổng hợp màng polianilin (PANi)
Màng PANi được tổng hợp trên vi điện cực tích hợp dropsens bằng phương pháp CV trong dung dịch nước có chứa H2SO4 0,5M, monome ANi 0,03M, khoảng thế từ -0,4 V đến 0,9 V, tốc độ quét 50mV/giây, trong 20 chu kỳ.
b.Cố định enzym lên bề mặt điện cực.
- Lấy 0,5μl dung dịch enzym ureaze nhỏ phủ lên bề mặt vi điện cực có màng Gr/PANi, tạo màng enzym mỏng, ủ trong hơi glutaraldehit 25% trong 24 giờ, sau đó làm khô trong không khí ở nhiệt độ thường.
- Điện cực sau khi cố định ureaza được rửa bằng nước khử ion để loại bỏ glutaraldehit dư.
Các màng PANi được lắng đọng điện hóa trên các vi điện cực bạch kim trần và các vi điện cực bạch kim được biến tính Gr bằng phương pháp CV trong 20 chu kỳ, khoảng thế làm việc -0,4 V đến + 0,9 V, tốc độ quét 50 mV/s. Dung dịch điện hóa chứa 0,3 M monome anilin và 0,5 M H2SO4.
Sau khi tổng hợp được màng PANi, điện cực được chạy ổn định trong dung dịch HCl 0,1M bằng phương pháp CV với khoảng thế làm việc-0,4V đến -0,9 V tốc độ quét 50mV/ s, số vòng quét thay đổi lần lượt 20 vòng, 10 vòng, 3 vòng
Các yếu tố môi trường như pH dung dịch, khoảng làm việc cũng như so sánh đối chứng với L-ascorpic được thực hiện để tối ưu hoá các điều kiện tổng hợp. Quy trình chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/ureaza được thể hiện trong hình 2.3 dưới đây.
Hình 2.3: Sơ đồ quá trình chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza 2.2.3. Phân tích mẫu nước tiểu
Để đánh giá hiệu quả của các điện cực biến tính chế tạo cũng như hiểu hơn về vai trò của các thành phần, các điện cực GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPs, GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs, Pt/Gr/PANi/Ureaza đã được sử dụng để phân tích mẫu sinh học, trong nhiều điều kiện khác nhau để so sánh 1 cách toàn diện. Độ chính xác của các phép phân tích được đánh giá bằng sai khác so với kết quả của đơn vị dịch vụ độc lập.
Cách lấy mẫu và bảo quản nước tiểu 24 giờ: Cho sẵn vào bình chứa mẫu10 mL HCl 10% khi thu lượm mẫu nước tiểu. Bệnh nhân đi tiểu ra ngoài cho kiệt, bắt đầu tính giờ để từ đó bắt đầu đi tiểu vào bình. Khi đủ 24 giờ, bệnh nhân đi tiểu lần cuối vào bình, thể tích thu được là nước tiểu 24 giờ. Thể tích nước tiểu cần được đo một cách chính xác và được ghi lại. Trường hợp cần bảo quản lâu hơn cần điều chỉnh nước tiểu về pH 4 và bảo quản trong ngăn đá cho đến khi phân tích [145, 146].
Trước khi phân tích, mẫu nước tiểu được rung siêu âm 15 phút, sau đó đem pha loãng với đệm PBS pH =7 theo tỷ lệ nước tiểu: đệm PBS là 3:500, tiến hành phân tích mẫu theo phương pháp thêm chuẩn. Phương pháp thêm chuẩn được sử dụng nhằm hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu. Lấy 0,3 mL mẫu vào 6 bình định mức riêng biệt có cùng thể tích 50 mL đã có sẵn khoảng 20 mL dung dịch đệm PBS nồng độ 0,1M, pH 7. Thêm vào mỗi bình các thể tích dung dịch tiêu chuẩn UA, Ure nồng độ 10-3M theo thể tích như bảng sau:
STT 1 2 3 4 5 6 V mẫu (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 V thêm (mL) 0 0,5 0,75 1,0 1,25 1,5 Vđịnh mức (mL) 50 50 50 50 50 50 C chuẩn (mol/L) 1×10-3 1×10-3 1×10-3 1×10-3 1×10-3 1×10-3 ∆C (M) 0 ∆C1 ∆C2 ∆C3 ∆C4 ∆C5 Ix I1 I2 I3 I4 I5 I6
Tiến hành đo DPV với điều kiện đo tối ưu của điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs và điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs; đo CV với điều kiện đo tối ưu của điện cực Pt/Gr/PANi/ureaza. Qui trình tiến hành phân tích có thể tóm tắt theo sơ đồ sau:
Theo phương pháp đường chuẩn:
Tiến hành đo tín hiệu von ampe xung vi phân để xác định cường độ tín hiệu dòng điện của mẫu (Ix) và các bình thêm chuẩn (I1 đến In). Vẽ đồ thị quan hệ giữa cường độ tín hiệu và biến thiên nồng độ I - ∆C, xác định phương trình hồi quy tuyến tính I = a×∆C + b
Kết quả hàm lượng UA trong mẫu nước tiểu được tính bằng mol/L theo phương pháp thêm chuẩn được tính theo công thức:
CUA = ��− �
� × � (3.2)
Trong đó: Ix: Cường độ tín hiệu dòng điện đo được khi đo mẫu thực. CUA: Nồng độ UA trong mẫu đo, tính bằng mol/L.
a và b: Các hệ số của phương trình hồi quy. K : là hệ số pha loãng.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs
3.1.1. Khảo sát điều kiện chế tạo màng Gr trên điện cực GCE
Trong điện cực biến tính xác định UA, Gr đóng vai trò là lớp dẫn điện. Độ dày của lớp Gr ảnh hưởng đến độ dẫn điện của điện cực biến tính mới chế tạo. Tiến hành khảo sát tổng hợp điện cực với 1 số hàm lượng Gr khác nhau. Các điện cực sau đó được đem đi phân tích UA ở các dải nồng độ phù hợp, thu được kết quả chi tiết ở bảng 3.1 và hình 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 với hàm lượng Gr khác nhau
Điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs (hàm lượng Gr 0,5 mg/mL) GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs (hàm lượng Gr 0,3 mg/mL) Khoảng tuyến tính (µM) (1) 11,9 – 186 (2) 186 - 362 11,9 - 434 Cường độ tín hiệu ( A) (1) 1,27 – 12,2 (2) 12,2 – 19,6 0,566 – 11,7 Độ nhạy (1) 0,0636 (2) 0,0418 0,0256 Hệ số tuyến tính (1) 0,992(2) 0,993 0,9911 E/V (A)
X
X
Hình 3.1: (A)Tín hiệu DPV, (B,C)đường chuẩn của điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs với UA trong dung dịch PBS pH 7 với độ dày lớp Gr khác nhau (1):
0,5 mg/mL; (2): 0,3 mg/mL
Kết quả cho thấy với hàm lượng Gr 0,5 mg/mL, điện cực tổng hợp có cường độ tín hiệu cũng như độ nhạy tăng lên đáng kể so với mức 0,3 mg/mL. Cụ thể, cường độ tín hiệu cũng như độ nhạy tăng khoảng 2 lần khi hàm lượng Gr thay đổi từ 0,3 lên 0,5 mg/mL. Như vậy, khi hàm lượng Gr tăng lên đã cải thiện đáng kể khả năng truyền tải điện tích của điện cực. Do vậy, chúng tôi sử dụng hàm lượng 0,5 mg/mL của Gr làm điều kiện tổng hợp trong các nghiên cứu sau này.
3.1.2. Khảo sát điều kiện chế tạo màng PDA-Cu(II)
3.1.2.1. Khảo sát phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II)
Màng PDA-Cu(II) được chế tạo theo 2 phương pháp khác nhau: CV và CA. Các điện cực sau đó được đem đi phân tích UA ở các dải nồng độ phù hợp, thu được kết quả chi tiết ở bảng 3.2 và hình 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 điện phân PDA – Cu theo hai phương pháp CA và CV
Phương pháp Khoảng tuyến tính (
M) Cường độ tín hiệu ( A) Độ nhạy Hệ số tương quan CV (1) 11,9-80,9 (2) 80,9-386 (1) 0,938-5,88 (2) 5,88-19,3 (1) 0,0712 (2) 0,044 (1) 0,9975 (2) 0,9939 CA (1) 11,9-80,9 (2) 80,9-319 (1) 2,47-13,1 (2) 13,1-30,3 (1) 0,1512 (2) 0,0717 (1) 0,991 (2) 0,9922 CUA / M CUA / M CA CV
Hình 3.2: Đường chuẩn và tín hiệu DPV của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 theo hai phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II) khác nhau
(Phương pháp CA và CV)
Kết quả cho thấy, đối với 2 phương pháp tổng hợp thì khoảng nồng độ làm
I µ
I µ
việc tương tự nhau. Tuy nhiên cường độ tín hiệu đối với mẫu điện cực tổng hợp theo phương pháp CA cao hơn đáng kể ở tất cả các khoảng nồng độ làm việc. Ngoài ra, độ nhạy của điện cực theo phương pháp CA cũng lớn hơn. Chính vì vậy, phương pháp CA được lựa chọn cho việc tổng hợp lớp màng PDA-Cu(II) trong các nghiên cứu sau này.
3.1.2.2. Khảo sát thời gian điện phân
Sử dụng phương pháp CA, chúng tôi tiến hành khảo sát với thời gian điện phân khác nhau nhằm lựa chọn được thời gian điện phân phù hợp. Thời gian điện phân khác nhau sẽ ảnh hưởng đến độ dày lớp PDA-Cu(II) trên bề mặt điện cực. Trong khảo sát này chúng tôi lựa chọn ở 4 khoảng thời gian khác nhau: 300s; 350s; 400s và 450s. Các điện cực sau khi được tổng hợp được đem đo đáp ứng điện hoá với UA trong PBS, pH=7. Kết quả chi tiết được thể hiện trong bảng 3.3 dưới đây.
Bảng 3.3: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 khi điện phân PDA – Cu ở các khoảng thời gian khác nhau
Thời gian 300s 350s 400s 450s Khoảng tuyến tính ( M) 23,4-441 (1)11,9-113 (2)113-386 11,9-319 (1)23,4-129 (2)129-386 Tín hiệu ( A) 0,763-7,6 (1)1,32-11,3 (2)11,3-26,7 1,27-14,9 (1)2,38-10,8 (2)10,8-22,2 Độ nhạy 0,0166 (1)0,0967 (2)0,0565 0,0442 (1)0,0789 (2)0,0446 Hệ số tương quan 0,9968 (1)0,9936 (2)0,9916 0,9918 (1)0,9977 (2)0,9919 Kết quả cho thấy, khoảng làm việc của các điện cực không bị ảnh hưởng quá nhiều bởi thời gian điện phân. Tuy nhiên cường độ tín hiệu và độ nhạy tăng dần khi tăng thời gian từ 300s đến 350s. Các giá trị này giảm xuống khi tăng thời gian điện phân. Chính vì vậy, trong các nghiên cứu sau này chúng tôi tiến hành tổng hợp