a. Chuẩn bị điện cực, chế tạo màng Gr theo phương pháp CVD
Các vi điện cực tích hợp điện hóa được chế tạo bằng công nghệ MEMS với đường kính của điện cực làm việc là 200 nm [144]
* Màng Gr được chế tạo theo phương pháp bay hơi lắng đọng hoá học (CVD)
- Cắt miếng Gr/Cu thành miếng nhỏ có kích thước bằng kích thước cần phủ lên điện cực làm việc (WE).
- Sử dụng miếng Teflon, tiến hành dùng dao dọc giấy tạo lỗ nhỏ ở giữa miếng ( lỗ nhỏ bằng miếng Gr/Cu)
-Đặt miếng Gr/Cu vào bên trong miếng Teflon( phần vừa tạo)
-Chuyển miếng Teflon chứa Gr/Cu vào khay ăn mòn chứa FeCl3 0,5M. - Sau 10 phút lớp Gr bên dưới bị tách ra, lắc nhẹ khay ăn mòn để lớp Gr bên dưới tách ra hoàn toàn.
-Chuyển qua khay ăn mòn đựng nước cất, rửa lại 3-4 lần bằng nước cất. -Chuyển vào khay ăn mòn chứa (NH4)2S2O8 0,5M.
-Khi hết Cu chuyển qua rửa lại bằng nước cất 5-6 lần.
-Rửa sạch bằng nước khử ion 3 lần, sau đó chuyển lên điện cực. -Sấy khô điện cực rồi kéo miếng Teflon ra
-Ủ điện cực ở 600C trong khí Ar.
* ổng hợp màng polianilin (PANi)
Màng PANi được tổng hợp trên vi điện cực tích hợp dropsens bằng phương pháp CV trong dung dịch nước có chứa H2SO4 0,5M, monome ANi 0,03M, khoảng thế từ -0,4 V đến 0,9 V, tốc độ quét 50mV/giây, trong 20 chu kỳ.
b.Cố định enzym lên bề mặt điện cực.
- Lấy 0,5μl dung dịch enzym ureaze nhỏ phủ lên bề mặt vi điện cực có màng Gr/PANi, tạo màng enzym mỏng, ủ trong hơi glutaraldehit 25% trong 24 giờ, sau đó làm khô trong không khí ở nhiệt độ thường.
- Điện cực sau khi cố định ureaza được rửa bằng nước khử ion để loại bỏ glutaraldehit dư.
Các màng PANi được lắng đọng điện hóa trên các vi điện cực bạch kim trần và các vi điện cực bạch kim được biến tính Gr bằng phương pháp CV trong 20 chu kỳ, khoảng thế làm việc -0,4 V đến + 0,9 V, tốc độ quét 50 mV/s. Dung dịch điện hóa chứa 0,3 M monome anilin và 0,5 M H2SO4.
Sau khi tổng hợp được màng PANi, điện cực được chạy ổn định trong dung dịch HCl 0,1M bằng phương pháp CV với khoảng thế làm việc-0,4V đến -0,9 V tốc độ quét 50mV/ s, số vòng quét thay đổi lần lượt 20 vòng, 10 vòng, 3 vòng
Các yếu tố môi trường như pH dung dịch, khoảng làm việc cũng như so sánh đối chứng với L-ascorpic được thực hiện để tối ưu hoá các điều kiện tổng hợp. Quy trình chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/ureaza được thể hiện trong hình 2.3 dưới đây.
Hình 2.3: Sơ đồ quá trình chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza 2.2.3. Phân tích mẫu nước tiểu
Để đánh giá hiệu quả của các điện cực biến tính chế tạo cũng như hiểu hơn về vai trò của các thành phần, các điện cực GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPs, GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs, Pt/Gr/PANi/Ureaza đã được sử dụng để phân tích mẫu sinh học, trong nhiều điều kiện khác nhau để so sánh 1 cách toàn diện. Độ chính xác của các phép phân tích được đánh giá bằng sai khác so với kết quả của đơn vị dịch vụ độc lập.
Cách lấy mẫu và bảo quản nước tiểu 24 giờ: Cho sẵn vào bình chứa mẫu10 mL HCl 10% khi thu lượm mẫu nước tiểu. Bệnh nhân đi tiểu ra ngoài cho kiệt, bắt đầu tính giờ để từ đó bắt đầu đi tiểu vào bình. Khi đủ 24 giờ, bệnh nhân đi tiểu lần cuối vào bình, thể tích thu được là nước tiểu 24 giờ. Thể tích nước tiểu cần được đo một cách chính xác và được ghi lại. Trường hợp cần bảo quản lâu hơn cần điều chỉnh nước tiểu về pH 4 và bảo quản trong ngăn đá cho đến khi phân tích [145, 146].
Trước khi phân tích, mẫu nước tiểu được rung siêu âm 15 phút, sau đó đem pha loãng với đệm PBS pH =7 theo tỷ lệ nước tiểu: đệm PBS là 3:500, tiến hành phân tích mẫu theo phương pháp thêm chuẩn. Phương pháp thêm chuẩn được sử dụng nhằm hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu. Lấy 0,3 mL mẫu vào 6 bình định mức riêng biệt có cùng thể tích 50 mL đã có sẵn khoảng 20 mL dung dịch đệm PBS nồng độ 0,1M, pH 7. Thêm vào mỗi bình các thể tích dung dịch tiêu chuẩn UA, Ure nồng độ 10-3M theo thể tích như bảng sau:
STT 1 2 3 4 5 6 V mẫu (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 V thêm (mL) 0 0,5 0,75 1,0 1,25 1,5 Vđịnh mức (mL) 50 50 50 50 50 50 C chuẩn (mol/L) 1×10-3 1×10-3 1×10-3 1×10-3 1×10-3 1×10-3 ∆C (M) 0 ∆C1 ∆C2 ∆C3 ∆C4 ∆C5 Ix I1 I2 I3 I4 I5 I6
Tiến hành đo DPV với điều kiện đo tối ưu của điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs và điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs; đo CV với điều kiện đo tối ưu của điện cực Pt/Gr/PANi/ureaza. Qui trình tiến hành phân tích có thể tóm tắt theo sơ đồ sau:
Theo phương pháp đường chuẩn:
Tiến hành đo tín hiệu von ampe xung vi phân để xác định cường độ tín hiệu dòng điện của mẫu (Ix) và các bình thêm chuẩn (I1 đến In). Vẽ đồ thị quan hệ giữa cường độ tín hiệu và biến thiên nồng độ I - ∆C, xác định phương trình hồi quy tuyến tính I = a×∆C + b
Kết quả hàm lượng UA trong mẫu nước tiểu được tính bằng mol/L theo phương pháp thêm chuẩn được tính theo công thức:
CUA = ��− �
� × � (3.2)
Trong đó: Ix: Cường độ tín hiệu dòng điện đo được khi đo mẫu thực. CUA: Nồng độ UA trong mẫu đo, tính bằng mol/L.
a và b: Các hệ số của phương trình hồi quy. K : là hệ số pha loãng.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs
3.1.1. Khảo sát điều kiện chế tạo màng Gr trên điện cực GCE
Trong điện cực biến tính xác định UA, Gr đóng vai trò là lớp dẫn điện. Độ dày của lớp Gr ảnh hưởng đến độ dẫn điện của điện cực biến tính mới chế tạo. Tiến hành khảo sát tổng hợp điện cực với 1 số hàm lượng Gr khác nhau. Các điện cực sau đó được đem đi phân tích UA ở các dải nồng độ phù hợp, thu được kết quả chi tiết ở bảng 3.1 và hình 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 với hàm lượng Gr khác nhau
Điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs (hàm lượng Gr 0,5 mg/mL) GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs (hàm lượng Gr 0,3 mg/mL) Khoảng tuyến tính (µM) (1) 11,9 – 186 (2) 186 - 362 11,9 - 434 Cường độ tín hiệu ( A) (1) 1,27 – 12,2 (2) 12,2 – 19,6 0,566 – 11,7 Độ nhạy (1) 0,0636 (2) 0,0418 0,0256 Hệ số tuyến tính (1) 0,992(2) 0,993 0,9911 E/V (A)
X
X
Hình 3.1: (A)Tín hiệu DPV, (B,C)đường chuẩn của điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs với UA trong dung dịch PBS pH 7 với độ dày lớp Gr khác nhau (1):
0,5 mg/mL; (2): 0,3 mg/mL
Kết quả cho thấy với hàm lượng Gr 0,5 mg/mL, điện cực tổng hợp có cường độ tín hiệu cũng như độ nhạy tăng lên đáng kể so với mức 0,3 mg/mL. Cụ thể, cường độ tín hiệu cũng như độ nhạy tăng khoảng 2 lần khi hàm lượng Gr thay đổi từ 0,3 lên 0,5 mg/mL. Như vậy, khi hàm lượng Gr tăng lên đã cải thiện đáng kể khả năng truyền tải điện tích của điện cực. Do vậy, chúng tôi sử dụng hàm lượng 0,5 mg/mL của Gr làm điều kiện tổng hợp trong các nghiên cứu sau này.
3.1.2. Khảo sát điều kiện chế tạo màng PDA-Cu(II)
3.1.2.1. Khảo sát phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II)
Màng PDA-Cu(II) được chế tạo theo 2 phương pháp khác nhau: CV và CA. Các điện cực sau đó được đem đi phân tích UA ở các dải nồng độ phù hợp, thu được kết quả chi tiết ở bảng 3.2 và hình 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 điện phân PDA – Cu theo hai phương pháp CA và CV
Phương pháp Khoảng tuyến tính (
M) Cường độ tín hiệu ( A) Độ nhạy Hệ số tương quan CV (1) 11,9-80,9 (2) 80,9-386 (1) 0,938-5,88 (2) 5,88-19,3 (1) 0,0712 (2) 0,044 (1) 0,9975 (2) 0,9939 CA (1) 11,9-80,9 (2) 80,9-319 (1) 2,47-13,1 (2) 13,1-30,3 (1) 0,1512 (2) 0,0717 (1) 0,991 (2) 0,9922 CUA / M CUA / M CA CV
Hình 3.2: Đường chuẩn và tín hiệu DPV của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 theo hai phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II) khác nhau
(Phương pháp CA và CV)
Kết quả cho thấy, đối với 2 phương pháp tổng hợp thì khoảng nồng độ làm
I µ
I µ
việc tương tự nhau. Tuy nhiên cường độ tín hiệu đối với mẫu điện cực tổng hợp theo phương pháp CA cao hơn đáng kể ở tất cả các khoảng nồng độ làm việc. Ngoài ra, độ nhạy của điện cực theo phương pháp CA cũng lớn hơn. Chính vì vậy, phương pháp CA được lựa chọn cho việc tổng hợp lớp màng PDA-Cu(II) trong các nghiên cứu sau này.
3.1.2.2. Khảo sát thời gian điện phân
Sử dụng phương pháp CA, chúng tôi tiến hành khảo sát với thời gian điện phân khác nhau nhằm lựa chọn được thời gian điện phân phù hợp. Thời gian điện phân khác nhau sẽ ảnh hưởng đến độ dày lớp PDA-Cu(II) trên bề mặt điện cực. Trong khảo sát này chúng tôi lựa chọn ở 4 khoảng thời gian khác nhau: 300s; 350s; 400s và 450s. Các điện cực sau khi được tổng hợp được đem đo đáp ứng điện hoá với UA trong PBS, pH=7. Kết quả chi tiết được thể hiện trong bảng 3.3 dưới đây.
Bảng 3.3: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 khi điện phân PDA – Cu ở các khoảng thời gian khác nhau
Thời gian 300s 350s 400s 450s Khoảng tuyến tính ( M) 23,4-441 (1)11,9-113 (2)113-386 11,9-319 (1)23,4-129 (2)129-386 Tín hiệu ( A) 0,763-7,6 (1)1,32-11,3 (2)11,3-26,7 1,27-14,9 (1)2,38-10,8 (2)10,8-22,2 Độ nhạy 0,0166 (1)0,0967 (2)0,0565 0,0442 (1)0,0789 (2)0,0446 Hệ số tương quan 0,9968 (1)0,9936 (2)0,9916 0,9918 (1)0,9977 (2)0,9919 Kết quả cho thấy, khoảng làm việc của các điện cực không bị ảnh hưởng quá nhiều bởi thời gian điện phân. Tuy nhiên cường độ tín hiệu và độ nhạy tăng dần khi tăng thời gian từ 300s đến 350s. Các giá trị này giảm xuống khi tăng thời gian điện phân. Chính vì vậy, trong các nghiên cứu sau này chúng tôi tiến hành tổng hợp màng PDA-Cu(II) với thời gian 350s.
3.1.3. Khảo sát điều kiện chế tạo GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs
Trong điện cực nghiên cứu của chúng tôi, các nano Cu đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao độ ổn định và độ bền của điện cực. Vai trò cụ thể của nano Cu cũng như các hợp phần cấu thành khác sẽ được nghiên cứu chi tiết ở mục cơ chế đề xuất cũng như phần kết quả tính toán lý thuyết.
Kết quả phân tích hình ảnh SEM của mẫu chứa Gr/PDA-Cu(II) và mẫu chứa thêm nano Cu Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs cho thấy có sự khác biệt rõ rệt. Đối với mẫu Gr/PDA-Cu(II), trên bề mặt xuất hiện nhiều các lớp Gr rõ nét. Trong khi đó, trên bề mặt mẫu Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs xuất hiện nhiều đốm sáng màu đặc trưng cho các cụm nano Cu bám trên bề mặt. Ngoài ra, phổ EDS của 2 mẫu Gr/PDA-Cu(II) và Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs cho thấy các đỉnh quan trọng đặc trung cho các nguyên tố C, O, Cu. Tỷ lệ phần trăm khối lượng của Cu trong vật liệu tổng hợp Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs cao hơn nhiều so với Gr/PDA-Cu(II) (18,56% so với 1,04%). Như vậy, nanocompozit Gr/PDA-Cu (II)/CuNPs đã được tổng hợp thành công, nano Cu đã bám dính trên bề mặt mẫu bằng phương pháp điện hoá.
Hình 3.3: Ảnh SEM và phổ EDS của GCE/Gr/PDA-Cu(II) (A & B) và GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs (C & D)
Lượng CuNPs nhiều hay ít phụ thuộc vào số vòng quét CV. Khi tăng số vòng quét, lượng CuNPs sẽ được hình thành nhiều hơn. Độ chọn lọc, độ nhạy và khả
năng đáp ứng của điện cực trong dung dịch Cu 3mM + HCl 0,01M được ghi nhận khi thay đổi 3 vòng, 5 vòng, 10 vòng, 15 vòng và 20 vòng. Theo kết quả khảo sát ở bảng 3.4 cho thấy khi số vòng điện phân tăng từ 3 đến 10 vòng thì khoảng tuyến tính, cường độ tín hiệu và độ nhạy của điện cực tăng dần, nhưng tiếp tục tăng số vòng điện phân lên 15 vòng, 20 vòng thì khoảng tuyến tính, cường độ tín hiệu và độ nhạy của điện cực lại giảm dần. Do đó, trong các nghiên cứu sau này, chúng tôi tiến hành quét trong 10 vòng để tổng hợp hợp lượng CuNPs phù hợp trên bề mặt điện cực.
Bảng 3.4: Đáp ứng của điện cực GC/Gr-PDA-Cu CuNPs với UA trong PBS pH 7 Số vòng quét CuNPs Khoảng tuyến tính (µM) Cường độ tín
hiệu (µA) Độ nhạy
Hệ số tương quan 3 (1)11,9-113 (2)113-319 (1)2,00-12,6 (2)12,6-24,1 (1)0,1025 (2)0,0563 (1)0,9916 (2)0,9917 5 (1)11,9-129 (2)129-319 (1)1,53-13,9 (2)13,9-25,7 (1)0,1046 (2)0,0617 (1)0,9955 (2)0,9923 10 (1)11,9-113 (2)113-386 (1)1,32-11,3 (2)11,3-26,7 (1)0,0967 (2)0,0565 (1)0,9936 (2)0,9916 15 (1)11,9-129 (2)129-386 (1)1,14-8,57 (2)8,57-18 (1)0,063 (2)0,037 (1)0,9909 (2)0,9952 20 (1)11,9-113 (2)113-319 (1)1,34-12,4 (2)12,4-23,1 (1)0,1062 (2)0,0522 (1)0,9945 (2)0,9913 3.1.4. Khảo sát các đặc trưng của điện cực GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs
3.1.4.1. Tính chất điện hóa
Các điện cực GCE/Gr; GCE/Gr/PDA–Cu(II); GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs sau khi tổng hợp sẽ được tiến hành đo CV trong dung dịch chứa K3FeCN)6/K4Fe(CN)6 5mM và KCl 0,1M từ -0,3V đến 0,5V, tốc độ quét 100mV/s nhằm thu được các thông số về điện hoá như cường độ dòng, diện tích bề mặt điện hoạt. Kết quả so sánh cho thấy điện cực GCE/Gr cho tín hiệu cường độ dòng lớn
nhất. Khi được biến tính tiếp bằng vật liệu PDA–Cu(II) thu được điện cực GCE/Gr/PDA–Cu(II), cường độ dòng tín hiệu giảm. Sự xuất hiện của các hạt nano kim loại đồng làm cho cường độ tín hiệu của điện cực GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs được cải thiện rõ rệt. Tính chất oxi hóa khử của cặp chất oxi hóa khử thuận nghịch được đảm bảo nhờ sự có mặt của các hạt nano kim loại đồng.
Hình 3.4: Tín hiệu CV khi quét dung dịch K3FeCN)6/K4Fe(CN)6 5mM và KCl 0,1M với các điện cực làm viêc: (1) GCE/Gr, (2)GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs; (3):
GCE/Gr/PDA – Cu(II);
- Diện tích bề mặt điện hoạt
Vì điện cực biến tính thường có giá trị diện tích bề mặt điện hoạt không đúng với diện tích bề mặt vật lý của chúng, nên cần thiết phải xác định giá trị này để làm sáng tỏ thêm về độ nhạy của điện cực biến tính. Bề mặt điện hoạt được xác định từ phương trình Randles-Sevcik [130, 147]:
ipa = (2,69105) n3/2.A.D1/2. C.1/2 (3.1)
Trong đó, ipa (A) là cường độ dòng tại vị trí pic (tương ứng với quá trình oxy hóa); n là số điện tử trao đổi trong phản ứng oxy hóa khử (n = 1); A (cm2) diện tích bề mặt điện hoạt của điện cực; D (cm2/s) là hệ số khuếch tán của ion [Fe(CN)6]4- trong dung dịch (D = 6,5.106cm2/s); C là nồng độ mol/cm3 của ion [Fe(CN)6]4- (1.10-6 mol/cm3) và (V/s) là tốc độ quét thế vòng tuần hoàn. Từ đồ thị
của phương trình biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính ipa và 1/2, xác định được diện tích bề mặt điện hoạt của điện cực.
Với tham chiếu đến phương trình và CV ở trên, diện tích bề mặt điện động của điện cực biến tính GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs được tính là 10.4 mm2, cao hơn khoảng 3 lần so với điện cực ban đầu GCE (3.14 mm2). Kết quả này quá trình biến tính điện cực đã thu được hiệu quả tốt. Điện cực sau biến tính có tính chất điện cực cao, rất quan trọng với các phân tích điện hoá sau này.
(A) (B)
Hình 3.5: (A) Đồ thị của dòng điện cực đại đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs trong 5,0 mM Fe (CN)6 4-/3- so với căn bậc hai của tốc độ quét; (B) Các tín hiệu CV của điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNP trong 5,0 mM Fe (CN)6
4-/3- ở các tốc độ quét khác nhau từ 10 đến 120 mV /s
E/V E/V
Hình 3.6: (A) CV của GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs trong 0,1 PBS (pH 7,0) trong 167 µM UA với tốc độ quét khác nhau từ 10 mV.s-1 đến 70 mV.s-1. (B) tín hiệu
DPV của UA trong 0,1 PBS (pH 7,0) tại GCE biến tính. I/
A
I/ A
Kết quả đo CV của điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNP trong đệm PBS