2.1.1. Nguyên liệu
Sữa bột nguyên kem
Sữa bột nguyên kem của công ty Fonterra Co-operative Group Ltd, được mua tại công ty cổ phần Đại Tân Việt, địa chỉ 145 Tôn Thất Đạm, phường Bến Nghé, quận 1, TP. Hồ Chí Minh được sử dụng cho nghiên cứu này. Thành phần hóa học của sữa bột nguyên kem được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của sữa bột nguyên kem
Thành phần Protein Độ ẩm Béo Tổng
Carbohydrate Khoáng
Khối lượng, g/100g bột 24,5 3,1 26,3 40,3 5,8
Số liệu được cung cấp từ COA (Certificate of Analyst – Bảng phân tích thành phần) của sản phẩm
Enzyme transglutaminase
Enzyme transglutaminase ACTIVE TG-SR-MH của Ajinomoto (Malaysia) (Berhad Co.No. 4295 –W), mua tại Công ty cổ phần phát triển Khoa học công nghệ Mỹ Úc, địa chỉ 783/40 Cách Mạng Tháng Tám, phường 6, quận Tân Bình TP. Hồ Chí Minh được sử dụng cho nghiên cứu này. Các thông số kỹ thuật của enzyme transglutaminase được cung cấp trong bảng 2.2.
25
Bảng 2.2. Một số thông số kỹ thuật của enzyme transglutaminase
CHỈ TIÊU GIÁ TRỊ
Hoạt độ Enzyme, U/g 36
Độ ẩm, % 6,5
Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/g 20
E.coli Không phát hiện
Số liệu được cung cấp từ COA của sản phẩm
Vi khuẩn lactic
Hỗn hợp vi khuẩn lactic gồm 2 chủng Lactobacilus bulgaricus và Streptococcus thermophilus của Công ty CHR. Hansen được sử dụng trong nghiên cứu này. Một số chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của chủng vi khuẩn lactic được thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của chủng vi khuẩn latic
CÁC CHỈ TIÊU Giá trị
pH tại 43°C, pH 4,7 – 5,1
Coliforms, MPN/g <10
Enterococci, CFU/g <100
Nấm mốc, CFU/g <10
Non lactic acid bacteria, CFU/g <500
Staphylococcus aureus, CFU/g <10
Nấm men, CFU/g <10
Salmonella spp., /25 g Không phát hiện
Listeria monocytogenes, /25 g Không phát hiện
Số liệu được cung cấp từ SPEC (Specification – Thông số kỹ thuật) của sản phẩm
2.1.2. Hóa chất
Sodium hydroxide (NaOH), Chloride acid (HCl) 0,1N, Kẽm oxide (ZnO), Sunfuric acid (H2SO4) 0,1N, Amoniac (NH3), Diethyl ether (C4H10O), Petroleum ether 60 - 90, Phenolphatlein (C20H1404), Acetone (C3H6O), Glutaraldehyde (0,1M đệm phosphate, pH
26
7,2), được mua tại Công ty TNHH Bách Khoa, địa chỉ kiot số 6, số 334 Tô Hiến Thành, phường 14, quận 10, TP. Hồ Chí Minh.
2.1.3. Thiết bị sử dụng
- Cân phân tích 4 số (Sartorious BL 210S) - Bể điều nhiệt Memmert (Đức)
- Bếp điện
- pH kế Mettler Toledo (Canada) - Tủ sấy Memmert (Đức)
- Tủ lạnh
- Tủ sấy chân không Memmert (Đức)
- Kính hiển vi điện tử quét FE – SEM, S4800, Hitachi (Nhật Bản) - Các dụng cụ: cốc đong, đĩa petri, erlen, pipet, biuret, ống bóp cao su.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
27
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
M1: Phô mai tươi làm từ sữa bột có xử lý enzyme, M2: Phô mai tươi làm từ sữa bột không xử lý enzyme, M3: Phô mai tươi làm từ sữa tươi có xử lý enzyme, M4: Phô mai tươi làm từ sữa tươi
không xử lý enzyme
Nguyên liệu
Khảo sát các yếu tố: Nồng độ enzyme (U/g protein), nhiệt độ xử lý enzyme (°C), thời gian xử lý enzyme (h)
Hàm mục tiêu: Năng suất thu hồi phô mai tươi
Thực nghiệm kiểm chứng
Thành phần hóa học: Tổng hàm lượng chất khô, protein, lipid.
Chỉ tiêu vi sinh: L. monocytogenes,
Staphylococci dương tính với coagulase.
So sánh vi cấu trúc của sản phẩm (chụp SEM): M1, M2, M3, M4
Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa năng suất tạo phô mai
Phân tích các chỉ tiêu của sản phẩm
Ảnh hưởng của enzyme đến chỉ tiêu cảm quan và vi cấu trúc của phô mai tươi được làm từ sữa bột và sữa tươi.
Khảo sát ảnh hưởng của enzyme đến chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản 4 mẫu: M1, M2, M3, M4
28
2.2.2. Quy trình sản xuất phô mai tươi
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình sản xuất phô mai tươi
Sữa bột nguyên kem Hoàn nguyên Lên men Xử lý enzyme Thanh trùng Tách whey Làm nguội
Phô mai tươi
45 – 50℃, 20 phút
85℃, 30 phút
E/S: 0,6 – 3 U/g protein T: 1,5 – 6h
℃: 30 - 60℃
43 ± 1℃, pH ≤ 4,6
29
Thuyết minh quy trình công nghệ Hoàn nguyên
Mục đích: Hoàn nguyên sữa bột trở lại trạng thái ban đầu như sữa tươi (dạng lỏng). Tổng hàm lượng chất khô đạt 15%.
Cách tiến hành: Hoàn nguyên 77,32 g sữa bột với 422,68 g nước ở nhiệt độ 45 - 50°C trong thời gian 20 phút (Bylund, 1995).
Thanh trùng
Mục đích: Tiêu diệt các vi sinh vật có hại
Cách tiến hành: Dịch sữa hoàn nguyên trước khi lên men được thanh trùng ở điều kiện 85°C trong 30 phút (Hongyu và cộng sự, 2001).
Xử lý Enzyme
Mục đích: Tạo điều kiện để enzyme transglutaminase xúc tác phản ứng hình thành liên kết ngang giữa các acid amin.
Cách tiến hành: Dung dịch sữa sau khi thanh trùng được đưa về nhiệt độ nghiên cứu (30 - 60°C) trước khi bổ sung enzyme. Hòa tan một lượng enzyme theo tỷ lệ nghiên cứu (0,6 – 3 U/g protein) vào trong dung dịch sữa và ủ hỗn hợp trong thời gian khảo sát (1,5 – 6h) trong bể ổn nhiệt.
Lên men
Mục đích: Giúp đông tụ các protein của sữa dưới sự hình thành acid latic, tạo mùi vị đặc trưng cho sản phẩm.
Cách tiến hành: Đưa hỗn hợp sữa sau khi ủ enzyme về nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men (43°C). Bổ sung trực tiếp 0,1g vi khuẩn lactic vào 500 ml hỗn hợp đó. Lên men trong tủ ổn nhiệt đến khi pH ≤ 4,6 thì ngừng. Thường quá trình lên men kéo dài từ 4,5 - 5h.
Làm nguội
Mụcđích: Làm nguội khối đông trước khi ép để ngăn chặn hoạt động của vi khuẩn latic trong quá trình ép, nhằm giữ ổn định pH của sản phẩm sau khi lên men.
30
Cách tiến hành: Đặt hủ chứa khối đông vào thau nước lạnh cho đến khi khối đông nguội thì đem ép tách whey.
Tách whey
Mục đích: Công đoạn này giúp loại bỏ những thành phần không đông tụ ra khỏi khối đông. Chúng bao gồm các protein hòa tan (whey protein), đường lactose, chất béo, acid lactic và chất khoáng (Bylund, 1995).
Cách tiến hành: Chúng tôi sử dụng kỹ thuật ép theo nghiên cứu của tác giả Nong Sun và William M.Breene, 1991 với một số thay đổi. Khối đông sau khi lên men được cho vào khuôn (kích thước 14 x 10,5 x 9,5 cm) đã lót sẵn vải ép. Đặt một mặt phẳng ép (có kích thước 12 x 9 cm) đè lên khối đông, tiếp tục dùng một vật nặng (khối lượng 1,5 kg) đè lên mặt phẳng và ép trong thời gian là 50 phút. Sau khi ép ta thu được sản phẩm phô mai tươi.
2.2.3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.1. Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa năng suất tạo phô mai
Mục đích: Tối ưu hóa điều kiện và chế độ xử lý Enzyme để thu được phô mai có năng suất cao.
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng trong nghiên cứu là phương pháp quy hoạch trực giao cấp 2 (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017).
Phương trình hồi quy có dạng:
Y = b0+ ∑𝑘𝑗=1𝑏𝑗𝑥𝑗 + ∑𝑘𝑗=1𝑏𝑗𝑙𝑥𝑗𝑥𝑖 + ∑𝑘𝑗=1𝑏𝑗𝑗𝑥𝑖2 (2.1)
Chọn 3 yếu tố để tiến hành khảo sát: - Nồng độ enzyme (Z1) – U/g protein - Nhiệt độ xử lý enzyme (Z2) – °C - Thời gian xử lý enzyme (Z3) – giờ (h)
- Hàm mục tiêu là Y: năng suất thu hồi phô mai tươi (%) Năng suất thu hồi phô mai tươi được xác định theo công thức 2.2.
H = 𝑚1
31 Trong đó:
m1 là khối lượng phô mai thu được, gam m0 là khối lượng sữa nguyên liệu ban đầu, gam
Tiến hành xây dựng mô hình toán thực nghiệm trực giao cấp 2 với k = 3 và số thí nghiệm ở tại tâm n0 = 4. Các biến x1, x2, x3 là các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3.
Bài toán xây dựng mô hình thực nghiệm: Y = f(x1,x2,x3)
Số thí nghiệm được xác định:
N = 2k + 2k + n0 (2.3)
Với: 2k: số thí nghiệm cơ sở (điểm thí nghiệm ở mức ± 1)
2k: số thí nghiệm điểm (*) (điểm thí nghiệm ở cánh tay đòn ±α ) n0 > 1: số thí nghiệm ở tâm (0)
Cánh tay đòn được xác định:
α = ((N.2(𝑘−2))0,5 - 2(𝑘−1))0,5 (2.4)
Điều kiện để ma trận trực giao: λ = 1
𝑁 (2k +2.α2 ) (2.5)
Phương trình hồi quy có dạng:
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b11 (𝑥12- λ) + b22 (𝑥22- λ)
+ b33 (𝑥32- λ) (2.6)
Trong đó: b0, b1, b2, b3, b13, b23, b11, b22, b33 là các hệ số của phương trình hồi quy, các hệ số được xác định độc lập và tính toán như sau:
bj = ∑ 𝑥𝑗𝑖 𝑁 𝑖=1 𝑦𝑖 ∑𝑁𝑖=1𝑥𝑗𝑖2 , bj1= ∑ (𝑥𝑗𝑥1)𝑖 𝑁 𝑖=1 𝑦𝑖 ∑𝑁𝑖=1(𝑥𝑗𝑥1)𝑖2 , bj j = ∑ (𝑥𝑗 2− λ)𝑖 𝑦𝑖 𝑁 𝑖=1 ∑𝑁𝑖=1(𝑥𝑗2− λ)𝑖2 (2.7)
Phương sai tái hiện:
Sb j = √ 𝑆𝑡ℎ 2 ∑𝑁𝑖=1𝑥𝑗𝑖2 , Sb j l = √ 𝑆𝑡ℎ2 ∑𝑁𝑖=1(𝑥𝑗𝑥1)𝑖2 , Sb j j = √ 𝑆𝑡ℎ 2 ∑ (𝑥𝑗2− 𝜆) 𝑖 2 𝑁 𝑖=1 (2.8)
32 Trong đó: Sth2 = ∑ (𝑦𝑖 𝑜−𝑦𝑇𝐵0 )2 𝑛0 𝑖 𝑛0−1 (2.9)
Sau khi tính được hệ số của phương trình hồi quy ta tiến hành kiểm định: - Ý nghĩa các hệ số hồi quy
- Sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm
Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy được thực hiện theo tiêu chuẩn Student
Ta có:
tj = |𝑏𝑗|
𝑆𝑏𝑗 (2.10)
Trong đó: bj hệ số thứ j trong phương trình hồi quy Sbj phương sai của hệ số thứ j
Nếu tp(f2) > tbj thì hệ số bj loại khỏi mô hình toán học.
Nếu tp(f2) < tbj thì hệ số bj được chấp nhận trong mô hình toán học.
Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher
S2du = ∑(𝑦𝑖−𝑦)̂
2
𝑓1 (2.11)
Trong đó: f1 = N – l, bậc tự do N: là số thí nghiệm;
l: hệ số có nghĩa trong phương trình hồi quy Ta có:
F = 𝑆𝑑𝑢
2
𝑆𝑡ℎ2 (2.12)
Ftra bảng (1 – p, f1, f2) với p = 0,05
Nếu F < Fp(f1, f2) thì mô hình toán tương thích.
33
2.2.3.2. Xác định các chỉ tiêu của sản phẩm
Mục đích: Xác định các chỉ tiêu chất lượng của mẫu phô mai tươi có chế độ xử lý enzyme tối ưu từ thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm.
Yếu tố cố định: Cố định các thông số xử lý enzyme của mẫu phô mai tươi có chế độ xử lý enzyme tối ưu.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định chỉ tiêu chất lượng sản phẩm
2.2.3.3. Ảnh hưởng của enzyme đến vi cấu trúc của phô mai tươi
Mục đích: So sánh hình ảnh vi cấu trúc của các mẫu phô mai tươi được làm từ sữa bột và sữa tươi, có và không có xử lý enzyme.
Bố trí thí nghiệm: Xác định thành phần hóa học Chỉ tiêu vi sinh Nguyên liệu Thanh trùng Xử lý Enzyme (sử dụng chế độ xử lý tối ưu) Lên men Làm nguội Tách whey
34
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của enzyme đến vi cấu trúc phô mai tươi
So sánh kết quả chụp SEM 4 mẫu
Nguyên liệu Sữa tươi Thanh trùng Sữa bột Hoàn nguyên Xử lý enzyme Không xử lý enzyme Lên men Làm nguội Tách whey
Phô mai tươi
Thanh trùng
Xử lý enzyme Không xử lý
35
2.2.4. Các phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu 2.2.4.1. Phân tích thành phần hóa học 2.2.4.1. Phân tích thành phần hóa học
Các thông số về tổng hàm lượng chất khô, tổng hàm lượng protein, lipid, % acid lactic là các thống số quan trọng để đánh giá chất lượng phô mai tươi.
Tổng hàm lượng chất khô, tổng hàm lượng protein, lipid của mẫu phô mai được xác định theo phương pháp được quy định trong TCVN. Tất cả các phép phân tích đều sử dụng mẫu đại diện và được lặp lại 3 lần.
Xác định tổng hàm lượng chất khô trong phô mai tươi theo TCVN 8176:2009
Hàm lượng chất khô tổng số là phần khối lượng của các chất còn lại sau khi kết thúc quá trình sấy. Nguyên tắc là nước trong phần mẫu thử được cho bay hơi với sự có mặt của kẽm oxit trong tủ sấy ở 102 oC ± 2 oC. Hàm lượng axit lactic được xác định để bù vào lượng nước đã mất do trung hòa.
Cách tiến hành: Sấy đĩa chứa khoảng 2 g kẽm oxit cùng với nắp và que khuấy trong tủ sấy ở 102°C ít nhất 1h. Để nguội trong bình hút ẩm sau đó cân khối lượng đĩa, kẽm oxit, nắp và que khuấy. Nghiêng đĩa để dồn kẽm oxit vào một bên của đĩa đã chuẩn bị. Cho khoảng 1 g mẫu thử đã chuẩn bị vào phần trống trong đĩa. Đậy nắp đĩa cùng với que khuấy ở trên. Cân đĩa cùng với nắp đậy và que khuấy ở trên, chính xác đến 1 mg. Bổ sung 5 ml nước vào phần mẫu thử trong đĩa. Dùng que khuấy để trộn kỹ phần mẫu thử đã pha loãng cùng với kẽm oxit. Dàn đều hỗn hợp trên đáy đĩa. Để que khuấy có đầu dẹt để trộn nằm trong hỗn hợp và đầu còn lại dựa trên thành đĩa. Cho đĩa mẫu đã chuẩn bị vào tủ sấy ở 102°C và sấy đến khối lượng không đổi.
Công thức tính hàm lượng chất khô W của mẫu thử, theo phần trăm khối lượng bằng công thức sau:
𝑤 =𝑚2−𝑚0
𝑚1−𝑚0. 100 + (0.1 𝑎) (2.13)
Trong đó:
m0 là khối lượng của đĩa (cả kẽm oxit), cùng với nắp đậy và que khuấy, tính bằng gam (g);
36
m1 là khối lượng của đĩa (cả kẽm oxit), cùng với nắp đậy và que khuấy và mẫu thử, tính bằng gam (g);
m2 là khối lượng của đĩa, cùng với nắp đậy, que khuấy và mẫu thử đã sấy khô (gồm cả kẽm oxit), tính bằng gam (g);
a là độ axit chuẩn độ thu được, tính bằng gam axit lactic trên 100 g sản phẩm, xác định theo TCVN 6509 (ISO 11869).
0,1 là giá trị bù cho sự hao hụt nước do kết quả trung hòa axit của sữa chua với kẽm oxit
Công thức tính % độ ẩm trong phô mai:
% Độ ẩm = 100 % Tổng hàm lượng chất khô (2.14)
Xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 8099-1:2015.
Nguyên tắc: Khi đun nóng trong môi trường H2SO4 đậm đặc với xúc tác CuSO4- K2SO4, hydro và cacbon của các hợp chất hữu cơ trong mẫu bị oxy hóa thành CO2 và H2O, còn nito sau khi giải phóng ra sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan vào dung dịch. Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng acid boric(H3BO3). Chuẩn độ dung dịch thu được bằng HCl. Từ đó xác định được hàm lượng nito trong mẫu, nhân lượng nito thu được với hệ số chuyển đổi => hàm lượng đạm tổng trong mẫu.
Cách tiến hành:
Cân 5 g mẫu bỏ vào bình Kjeldahl. Cho chất xúc tác vào (15 g kali sulfat, 1 ml dung dịch đồng (II) sunfat) và 25 ml axid sulfuric đậm đặc, gia nhiệt, phân hủy cho đến khi dung dịch mẫu trở nên trong suốt. Ammonium sulfate không bay hơi được hình thành từ phản ứng của nitơ và acid sulfuric.
(2.15) Acid sulfuric đậm đặc Nhiệt, chất xúc tác (NH4)2SO4 + SO2+ CO2 + H2O Protein
37
Trong quá trình phân hủy, nitơ protein được giải phóng để tạo thành các ion amoni, acid sulfuric oxy hóa chất hữu cơ và kết hợp với amoni tạo thành, các nguyên tố carbon và hydro được chuyển đổi thành carbon dioxid và nước.
Dung dịch sau khi phân hủy được pha loãng với nước. Bật bộ ngưng tụ nước của thiết bị chưng cất. Thêm 75 ml NaOH vào dịch phân hủy đã pha loãng. Ngay sau khi bổ sung dung dịch natri hydroxit vào bình Kjeldahl thì nối ngay bình vào thiết bị chưng cất, đầu ra của ống ngưng ngập trong 50 ml dung dịch axit boric. Amoniac tạo thành được chưng cất vào dung dịch acid boric có chứa các chỉ thị xanh methylen và methyl đỏ.
(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O (2.16)
NH3 + H3BO3 → NH4 + H2BO3- (2.17)
Anion borate (tỉ lệ với lượng nitơ) được chuẩn độ bằng HCl chuẩn.
H2BO3- + H+ → H3BO3 (2.18)
Chuẩn độ mẫu trắng bằng dung dịch thể tích chuẩn axit clohydric. Thay phần mẫu thử bằng 5 ml nước và khoảng 0,85 g sacarose.
Tính toán:
Số mol HCl = Số mol NH3 = số mol N trong mẫu
Tính hàm lượng Nito, Wn trong mẫu thử bằng công thức sau: 𝑊𝑛 =1,4007 (𝑉𝑠−𝑉𝑏)𝑀𝑡
𝑚 (2.19)
Trong đó:
Wn là hàm lượng nito của mẫu, tính bằng phần trăm khối lượng (%).
Vs là thể tích của dung dịch thể tích chuẩn axit clohydric được sử dụng trong phép xác định (ml).
Vb là thể tích của dung dịch thể tích chuẩn axit clohydric được sử dụng trong phép