Phân loại các phương pháp sắc ký

Một phần của tài liệu Khóa luận Nghiên cứu thành phần các lipid từ loài sao biển Anthenea aspera (Trang 36 - 39)

M Ở ĐẦU

1.4.2. Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phƣơng pháp sắc ký, pha động là các lƣu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.

1.4.2.1. Theo trạng thái tập hợp của pha động:

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm: sắc ký khí và sắc ký lỏng.

1.4.2.1.1. Sắc ký lỏng (LC)

Là phƣơng pháp sắc ký dùng chất lỏng làm pha động. Sắc ký lỏng bao gồm các loại sau:

a. Sắc ký giấy

Sắc ký giấy là phƣơng pháp phân tích với pha tĩnh, là loại giấy đặc hiệu dùng trong sắc ký. Chất thử đƣợc chấm lên giấy rồi triển khai sắc ký bằng hệ dung môi thích hợp trong một hệ triển khai kín. Sau khi đã triển khai xong giấy đƣợc làm khô rồi làm xuất hiện màu để xác định các vết chất có trong hỗn hợp chất thử. Các chất có màu có thể phát hiện ngay bằng mắt thƣờng nhƣng phần lớn các hợp chất hữu cơ thƣờng không có màu nên muốn nhìn thấy các vết chất cần sử dụng phƣơng pháp hóa học hoặc vật lý.

Với phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta thƣờng dùng các thuốc thử hiện màu đặc trƣng cho từng loại hợp chất. thuốc thửđƣợc pha thành dung dịch có nồng độ thích

hợp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc nhúng giấy vào dung dịch thuốc thử.

Với phƣơng pháp vật lý, ngƣời ta làm hiện màu bằng cách soi vào đèn UV do có nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụđƣợc tia cực tím.

b. Sắc ký cột

Đây là phƣơng pháp sắc kí đơn giản nhất, phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh sốđĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thƣớc của chất hấp phụ càng nhỏ thì sốđĩa lí thuyết càng lớn, khảnăng tách càng cao, và ngƣợc lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy đƣợc). Khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đƣờng kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khảnăng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.

Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.

Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.

Trong sắc kí cột, việc đƣa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thểđƣa chất lên cột bằng các phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel

rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên cột. Nếu tách tinh thì đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lƣợng tối thiểu.

Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụlà Silicagel pha thƣờng và pha đảo. Silicagel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 µm, Fujisilisa Chemical Ltd.).

c. Sắc kí lớp mỏng.

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định hƣớng cho sắc kí cột. SKLM đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản đƣợc tráng sẵn silicagel dày hơn), có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, ngƣời ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.

Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từcho đến khi hiện màu.

1.4.2.2.2. Sắc kí khí

Pha động trong trƣờng hợp này là các khí mang nhƣ N2, H2, He. Tùy vào bản chất của pha tĩnh mà ngƣời ta phân loại sắc ký khí làm 2 loại:

- Sắc ký khí - lỏng:

+ Pha tĩnh là lỏng đƣợc phủ lên bề mặt rắn của một chất mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên trong chất mang của cột.

+ Mẫu phải đƣợc hóa hơi và đƣợc khi mang đƣa đi qua cột.

+ Kỹ thuật này đƣợc Martin và Synge đƣa ra vào năm 1941 để thay thế pha động là lỏng, điều này dẫn đến làm tăng khả năng tách các họp chất từ trong mẫu ban đầu. Hệ số phân bốK là đặc trƣng cho quá trình tách.

+ Trong sắc kí loài này pha tĩnh ở dạng rắn xốp nhƣ than hoạt tính, silicagel, bột nhôm. Pha động là khí.

+ Sắc ký loại này ảnh hƣởng tới những cấu tử trong hỗn hợp có nhiệt độ sôi thấp. Hệ số hấp thụlà đặc trƣng cho quá trình.

1.4.2.3. Theo cách cho pha động chạy ta có:

a. Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chất chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh).

b. Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất lần lƣợt ra ngoài pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy)..

Một phần của tài liệu Khóa luận Nghiên cứu thành phần các lipid từ loài sao biển Anthenea aspera (Trang 36 - 39)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(58 trang)